מודלים vivo לשעבר של גליובלסטומה (GBM) אינם מותאמים למחקר רלוונטי מבחינה פיזיולוגית של הפלישה של הגידול האנושי. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לייצור ותחזוקה של תרבויות פרוסה organotypic מרקמת GBM אדם טרי. תיאור של זמן לשגות מיקרוסקופיה ו כמותי תא הגירה טכניקות ניתוח מסופק.
Glioblastoma (GBM) ממשיך לשאת פרוגנוזה קלינית ירודה ביותר למרות טיפול כירורגי, כימותרפי, והקרנות. הפלישה המתקדמת של הגידול לתוך פרנכימה במוח מייצגת אתגר טיפולי מתמשך. כדי לפתח טיפולים נגד הגירה עבור GBM, מערכות מודל המספקים רקע רלוונטי מבחינה פיזיולוגית לניסוי מבוקר חיוניים. כאן, אנו מציגים פרוטוקול ליצירת תרבויות פרוסה מרקמת GBM האדם שהושג במהלך כריתה כירורגית. תרבויות אלה מאפשרים ניסויים vivo לשעבר ללא passaging דרך xenografts בעלי חיים או תרבויות תא בודד. יתר על כן, אנו מתארים את השימוש של זמן לשגות לייזר סריקה מיקרוסקופיה confocal בשיתוף עם מעקב תא כדי ללמוד באופן כמותי את ההתנהגות הנדידה של תאים סרטניים התגובה הקשורים לתרפוי. פרוסות הם reproducibly שנוצר בתוך 90 דקות של רכישת רקמות כירורגיות. Retrovirally בתיווך תא פלואורסצנטי להBeling, הדמיה confocal, ותאי הגירה הגידול התא הם השלימו לאחר מכן בתוך שבועיים של תרבות. השתמשנו בהצלחה אלה תרבויות פרוסה לחשוף גורמים גנטיים הקשורים הגדילה את התנהגות הנדידה GBM האדם. יתר על כן, יש לנו אימות של היכולת של המודל לזהות וריאציה ספציפית למטופל בתגובה טיפולים נגד הגירה. לנוע קדימה, תרבויות פרוסות GBM האדם הם פלטפורמה אטרקטיבית להערכה מהירה vivo מהיר של רגישות הגידול לסוכנים טיפוליים, על מנת לקדם טיפול נוירו אונקולוגי אישית.
מחקר המעבדה של glioblastoma (GBM), הוא הפריע על ידי חוסר מודלים כי בנאמנות לסכם את המאפיינים הפתולוגיים הנדרשים של המחלה האנושית, כלומר גידול תאים וגידול הפלישה. מחקרים השוואתיים של 2D ו -3 D במבחני הפלישה חוץ גופית, כמו גם מודלים 3D מכרסמים תרבות פרוסה חשפו מכנית שונה תוכניות העברה הסלולר בשני הקשרים אלה, פוטנציאל הגבלת translatability של ממצאים ממערכות 2D למחלה אנושית 1 , 2 , 3 . התרבות organotypic פרוסה התרבות פרדיגמה הדמיה שתוארו כאן מאפשר המחקר של הגירה תא הגידול בתוך פרוסות של רקמה vivo הגידול האנושי לשעבר המתקבל כריתה כירורגית. לפיכך, פרוסות תרבויות של רקמת הגידול רקד כיתוב יחד עם מיקרוסקופיה פרוטוקול זמן לשגות לספק פלטפורמה ללמוד הגירה תא הגידול ילידMicroenvironment ללא פירוק רקמות או תרבות passaging.
יש ספרות מקיפה המעסיקים מכרסמים המוח מודלים התרבות פרוסה של GBM שנוצר xenografts הגידול האנושי, גידולים המושרה רטרובירל, ואת שכבות הסלולר ללמוד הפלישה הגידול 1 , 2 , 3 , 4 , 5 . לאחרונה, כמה קבוצות תיארו את הדור של תרבויות פרוסה organotypic ישירות מ GBM רקמות האדם 6 , 7 , 8 , 9 , 10 . עם זאת, יש וריאציה ניכרת בין הפרוטוקולים שפורסמו לגבי חיתוך טכניקה תרבות התקשורת. יתר על כן, השימוש בתרבויות פרוסה organotypic התמקדה endpoints סטטי סטטי שכלל שינויים Cell signaliNg, התפשטות, ומוות. הפרוטוקול המתואר כאן מרחיב על פרדיגמות תרבות פרוסה קודם על ידי שילוב תצפית נפתרה זמן של התאים תאים סרטניים דינמיים באמצעות מיקרוסקופיית זמן לסרוק מיקרוסקופיה confocal. גילוי אחרון של 11 בין 11 ו intratumoral 12 , 13 וריאציה גנטית האדם GBM מדגיש את החשיבות של קישור הטרוגניות זו עם התאים התא הגידול והשלכותיה על התגובה הגידול לטיפול. כאן, אנו מדווחים פרוטוקול יעיל לשחזור לשימוש של תרבויות פרוסה ישירה מרקמת סרטן האדם לדמיין הגירה תא הגידול כמעט בזמן אמת.
תרבויות פרוסה Organotypic מרקמת סרטן האדם לספק פלטפורמה אטרקטיבית underutilized עבור ניסויים טרנסציוניים pre-Clinical. ההבנה של התנהגויות ברמת האוכלוסייה של תאים סרטניים לגבי הגירה, התפשטות, ומוות של תאים microenvironment הגידול המקומי הוא חסר. באופן ביקורתי, לימוד תגובת הגידול לטיפול באופ?…
The authors have nothing to disclose.
ברצוננו להודות ד"ר לי Niswander וד"ר ראדה Massarwa על המומחיות הטכנית שלהם תרומות לפרוסה פרוטוקול confocal הדמיה פרוטוקול המתואר כאן. תודה רבה לד"ר קאלן Dionne שסיפק מומחיות לגבי אופטימיזציה של המוח חיתוך רקמת הגידול ופרמטרים תרבות.
DMEM High Glucose | Invitrogen (Gibco) | 11960-044 | |
Neurobasal-A Medium, minus phenol red | Invitrogen (Gibco) | 12349-015 | |
B-27 Supplement (50X), serum free | Invitrogen (Gibco) | 17504-044 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Invitrogen (Gibco) | 15140-122 | |
GlutaMAX Supplement | Invitrogen (Gibco) | 35050-061 | |
L-Glutamine (200 mM) | Invitrogen (Gibco) | 25030-081 | |
HEPES (1 M) | Invitrogen (Gibco) | 15630-080 | |
Nystatin Suspension | Sigma-Aldrich | N1638-20ML | 10,000 unit/mL in DPBS, aseptically processed, BioReagent, suitable for cell culture |
UltraPure Low Melting Point Agarose | Invitrogen (Gibco) | 16520-050 | Melts at 65.5 C, Remains fluid at 37 C, and sets rapidly below 25 C. |
Isolectin GS-IB4 from Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 647 Conjugate | Thermo Fisher (Molecular Probes) | I32450 | Used in media to label Microglia/Macrophages |
pRetroX-IRES-ZsGreen1 Vector | Clonetech | 632520 | |
Retro-X Concentrator | Clonetech | 31455 | Binding resin for non-ultracentrifugation concentration of viral supernatants |
pVSG-G Vector | Clonetech | 631530 | part of the Retro-X Universal Retroviral Expression System |
GP2-293 Viral packaging cells | Clonetech | 631530 | part of the Retro-X Universal Retroviral Expression System |
Cyanoacrylate Glue (Super Glue) | Sigma-Aldrich | Z105899 | Medium-viscosity |
Equipment | |||
Peel-A-Way Embedding Mold (Square – S22) | Polysciences, Inc. | 18646A-1 | Molds for tumor sample embedding |
Stainless Steel Micro Spatulas | Fisher Scientific | S50823 | Bend instrument 45 degrees at the neck of the spoon blade |
Curved Fisherbrand Dissecting Fine-Pointed Forceps | Fisher Scientific | 08-875 | |
Single Edge Razor Blade (American Safety Razors) | Fisher Scientific | 17-989-001 | Blade edge is 0.009" thick. Crimped blunt-edge cover is removed before loading onto vibratome. |
Leica VT1000 S Vibratome | Leica Biosystems | VT1000 S | |
Hydrophilic PTFE cell culture insert | EMD Millipore | PICM0RG50 | 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm pore size |
35 mm Glass Bottom Dishes | MatTek | P35G-1.5-20-C Sleeve | 20mm glass diameter. Coverslip glass thickness 1.5 |
LSM 510 Confocal Micoscope | Zeiss | LSM 510 | 10x Air Objective (c-Apochromat NA 0.45) |
PECON Stagetop Incubator | PeCON Germany | (Discontinued) | Incubator PM 2000 RBT is a comprable product designed for use with Zeiss Microscopes. |