Akış sitometri T hücreleri içinde kromatin durumunu değerlendirmek için kullanılabilir. Bu protokol, bilim adamları, floresan Histon H3 antikorların ortalama florasan yoğunluğu (MFI) bir artış gösterdiği, T hücresi aktivasyonu sırasında kromatin yoğunlaşması kanıt yorumlama sağlar
Uygun bir immün tepkisi sırasında hareketsiz T hücrelerinin, antijen-spesifik T hücre reseptörü antijen sunma üzerine aktive olmaktadır. Bu antijeni tanıyan bir reseptör taşıyan yalnızca T hücrelerinin klonal bir çoğalmaya neden olur. Kromatin Dekondenzasyon T hücre aktivasyonunun bir özelliğidir ve T hücreleri antijen nişan sonra çoğalmaya yeteneği kazanmak için gereklidir. Kromatin yoğunlaşması bu değişiklik, histon proteinlere karşı antikorlar kullanılarak tespit edilebilir. Bu antikorlar aktive T hücreleri yanı olabildiğince naif T hücrelerinin kendi epitoplara bağlanan olamaz. Biz aynı anda fixable ölü hücre leke T hücre-spesifik yüzey belirteçleri, parça canlılığını leke ve Histone H3 proteinlerinin hücre içi boyama yoluyla kromatin durumunu ölçmek için nasıl açıklar. Boyanmış hücreler akış sitometrisi ile analiz edilir ve kromatin kondensasyonu durumu Histon H3 leke ortalama floresan yoğunluğu (MFI) olarak ölçülür. ChromatT hücresi aktivasyonu sırasında yoğunlaşması olarak MFI bir artış olarak gösterilmiştir
Akış sitometri hücre popülasyonlarında birden fazla fiziksel ve floresan parametre analizi için geliştirilmiş bir lazer tabanlı bir teknolojidir. Bu teknoloji ile ilgili veya hücre içindeki sıvı karşılaşma akımında süspanse hücreler olarak bir lazer, heyecan verici bir floresan markör çalışır. Bu işaretler daha sonra tespit edilir ve foto-çoklayıcı tup ile belirlenir ışık yayar. Akış sitometrisi, geleneksel hücre popülasyonları tanımlamak için kullanılmış olsa da, bu, hücre zarı bütünlüğünün, protein-protein etkileşimleri ve protein değiş 1-3 dahil olmak üzere hücre özelliklerinin bir dizi incelenirken yararlı bir teknoloji olduğu kanıtlanmıştır. Bu teknolojisi, in vitro 4'te aktive T hücrelerinde kromatin durumunu tespit etmek için kullanılabilir sağlayan bir protokol geliştirilmiştir. Ayrıca T hücrelerinin 5 aktivasyonu ile uyarılan kromatin yoğunlaşması mekanizmasını araştırmak için bu protokolü kullanılır.
T hücresi activation ve proliferasyonu uygun bir immün tepkisi için kritik öneme sahiptir. T hücreleri, bağışıklık sistemi içinde lenfositlerin belirli bir alt grubu, uygun bağışıklık tepkilerinin ve immünolojik hafızanın geliştirilmesi için gereklidir. Bir antijen (6 gözden) hareketsiz T hücrelerinin hücre dışı yüzeyinde yer alan, T hücre reseptörünün (TCR), başlıca uyumluluk kompleksi içinde mevcut olduğunda Aktivasyon başlatılır. Bu hücre içi Ca2 + konsantrasyonu 7 ve (8-10 gözden) aktivasyonu için gerekli transkripsiyon faktörlerinin nükleer translokasyonunun bir artışa sonuçlanan T hücreleri içinde, dinamik ve çok düzenli moleküler olaylar dizisi tetikler. Bir kez, T hücreleri, interlökin-2 (IL-2), JAK (Janus Kinaz) / STAT kullanan güçlü bir büyüme faktörü yanıt yeteneği kazandırmak aktif (sinyal ileticisi ve bir aktivatör) yolu aktive T klonal proliferasyonunu tahrik etmek Hücreler 11. Kısaca, IL-2 ile uyarılması,STAT proteinleri latent sitosolik transkripsiyon faktörü ailesinin bir fosforilasyon ile sonuçlanır. Fosforile sonra STAT proteinleri dimerize, nükleuslar transloke edilebilir ve hücre döngüsü ilerlemesinde yer de dahil olmak üzere gen ekspresyonunu tahrik. T hücrelerinde, T hücre çoğalması için gerekli olan 12,13 STAT5 yoluyla, IL-2 sinyaller.
Aktive edilmiş T hücrelerinin klonal genişlemesini sağlamak için, antijen TCR nişan (naif T hücreleri) yaşamamış bu hücrelerin, IL-2 için güçlü etkileri göz ardı etmek için bir mekanizma olmalıdır. Bu kromatin durumunun düzenlenmesi yoluyla elde edilir. Saf T hücreleri, IL-2 bir uyarıya yanıt olarak STAT5 DNA nişan yasaklayan bir yoğunlaştırılmış kromatin sahiptirler. Aktivasyonu üzerine, kromatin decondenses ve STAT5 klonal proliferasyonunu 4 izin hedef genlerin promotörleri erişebilir. İlginç bir şekilde, kromatin durumundaki bu değişiklik histon protein, epigenetik modifikasyonu bağımlı değildirns (inceleme için, 14 bakınız) Ayrıca T-hücresi aktivasyonu sırasında 4 histon modifikasyonu hiçbir genel bir değişiklik görüldüğü gibi.
Bu çalışmaları gerçekleştirirken, biz histon proteinlerine karşı yükseltilmiş antikorlar da naif hücrelerde kendi epitopları erişim zorluk olduğunu keşfetti, ama aktivasyon üzerine bu daha kolay kendi epitopları 4 bağlamak olabilir. Bu nedenle, histon, antikor kromatin yoğunlaşması durum için bir okuma olarak hizmet vermektedir. Burada yöntem, T hücrelerinin kromatin durumunu değerlendirmek için floresan konjuge Histon H3 antikorları tespit etmek için akış sitometrisi kullanımı sunulmaktadır. Bir hücre popülasyonunda kromatin kondensasyonu Histon H3 boyama ortalama florasan yoğunluğu (MFI) olarak ölçülür. Kromatin dekondenzasyon anlamına T hücresi aktivasyonu, Histone H3 boyama artar MFI, bağlamında. Hücre içi Histon H3 boyama ile kromatin durumunu ölçülmesine ek olarak, bu protokol, aynı zamanda incorporates hücre alt popülasyonlarının analizini izin, boyama ve canlı hücreler için bir fixable leke yüzey.
Biz T hücrelerinde kromatin yoğunlaşması değerlendirilmesi için izin veren bir protokol geliştirmiştir. Bu Histon H3 antikorlar saf hücrelerde kolaylıkla kendi epitoplarını erişemez basit bir gözleme dayanır fakat T hücresi aktivasyonu üzerine, bu aynı antikorlar epitoplara bağlanan edebiliyoruz. Tedavi grupları arasında MFI Histon H3 lekelenmesini karşılaştırarak, yoğunlaşma veya yoğunlaşması nispi derecede tespit edilebilir. Biz timosit geliştirme sırasında ve T hücre aktivasyonu 4 sırasında göreceli yoğunlaşma durumunu belirlemek için bu protokolü kullanılır. Biz de Dekondenzasyon sürecini 5 kontrol mekanizmaları araştırmak için bu protokolü kullanılır.
Bu protokol, kromatin kondensasyonu durumunu tespit etmek için bir histon H3 antikoru kullanımına dayanır. T hücresi aktivasyonu 4 boyunca histon modifikasyon hiçbir genel değişiklik olduğundan, kromatin değerlendirmek için H3K4me1 antikor kullanabilmektedirlerBu protokolde durum. Biz değiştirilmemiş histon H3 karşı ortaya antikorlar kullandık; Ancak, üretilen sinyal çok daha zayıf genel oldu. Değiştirilmemiş histon H3 karşı antikorlar Western blot daha iyi çalışırken bizim deneyim, modifiye Histone H3 karşı yükseltilmiş antikorlar, immünofloresan daha iyi çalışması ve sitometri deneyleri akış. Biz bu teşebbüs değil, her ne kadar diğer histon proteinlere karşı antikorların kullanımı mümkün olduğuna dikkat edilmelidir.
Perm / Blok ve Histone H3 antikor adımlar protokolde en kritik adımlar. Kullanılan Perm / Blok çözeltisi miktarı hazır Perm çözeltisi yapılan her optimize edilmesi gerekmektedir. Bu stok çözeltinin farklı yoğunluktaki performansının karşılaştırılması ile yapılabilir. Tipik bir deneyde, 3 saat (Şekil 4) aktive kişilerce naiv T hücrelerinde kromatin durumunu karşılaştırılmasını içerir. Bir aşkın MFI en büyük değişiklik üreten seyreltme seçmelisinizsüre analiz. Stok çözeltisi, birinci aşamada 3,5 Perm / Block ilave o zaman adım 3,4 sonrasında kadar 100 ml olarak PBS +% 2 içinde yeniden süspansiyona tarafından Perm / Blok gücünü azaltmak için PBS +% 2 seyreltilebilir. Benzer bir deney, bir pilot floresan konjuge Histon H3 antikoru, antikorun, bir yeni bir parti etiketli her defasında farklı bir dilüsyonları test etmek için kullanılır. Bu adımlar (aktivasyon 3 saat içerisinde, örneğin) ilk T hücresi aktivasyonunda kondansasyon farklılıkların başarılı bir şekilde saptanması için özellikle kritiktir. Bazen, Histon H3 antikoru ile leke yapmaz dolayısıyla permeabilize olsun ve do not hücreler vardır. Bu Perm / Blok eklerken hücreleri de yeniden süspanse değilse ne ya edebilir Perm / Blok yeterince güçlü değilse. Bu hücreler histon H3 boyanma bir histogram görüntülenmesi sırasında eksene karşı bastırdı olaylar gibi görünecektir. Genel MFI çarpık olacak bu olaylar bu yana, bu olaylar gatin tarafından analiz ihmal edilebilirg histon H3 pozitif hücrelerin normal dağılım. Ek destek Sorun Giderme Kılavuzu (Tablo 1) bulunabilir.
Bir tamir edilebilir ölü hücre leke dahil tahlilinde hücre canlılığının değerlendirmesi için olanak sağlar. Bazı uyaranlara hücre ölümüne neden olabilir, çünkü T hücresi aktivasyonunu manipüle bu derece önemlidir. Böyle bir durumda, histon H3 antikoru sonuçlarının yanlış yorumlanmasına yol canlı hücrelere göre farklı ölü hücreleri histonlar bağlanabilir.
Bu protokol, kromatin durum yüksek bir verim analizine izin, 96 kuyucuklu bir plaka biçiminde kullanım için tasarlanmıştır. 6-8 haftalık dişi fareden bir dalak genellikle protokolü kullanılarak milyon 60-90 arası hücreleri verecektir. Boyama protokolü örnek başına 2.000.000 hücre gerektirdiğinden, kolayca tek bir 96-çukurlu plaka tek bir dalak üç kopya halinde birden fazla tedavi grupları ve zaman noktaları test edilebilir. Bu p mümkündürörnek başına daha az hücreleri ile protokol ERFORM; Bununla birlikte, bağlı santrifüj adımları sayısı ve bu adımların her biri hücrelerin doğal kaybı, çok hücrelerin sayısını azaltmak için tavsiye edilmez. Biz başarıyla numune başına 1.000.000 hücreleri ile protokol tamamladık.
Bu CD4 + T yardımcı hücreleri ve CD8 + sitotoksik T-hücrelerinde, kromatin durumunu incelemek için bu protokolü kullanılır. Protokol standardı bir yüzey boyama dahildir, bu mümkün olmaktadır. Protokolü kolay popülasyon spesifik yüzey belirteçleri karşı antikorlar kullanılarak, diğer lenfosit alt bölgesindeki kromatin incelenmesi için adapte edilebilir. Bu protokol, aynı zamanda kolayca ilgili yüzey belirteçleri tanıyan antikorlar sürece diğer hücre türleri için kullanılabilir ve uygun sabitleme / permeabilizasyon koşulları bilinmektedir olan uyarlanabilir.
The authors have nothing to disclose.
Bu proje Ulusal Sağlık Enstitüleri (5 P20 RR016461 ve 8 P20 GM103499) hibe tarafından desteklenen, Ulusal Bilim Vakfı (EPS-0903795). Furman Üniversitesi Araştırma ve Mesleki Büyüme ve Furman Avantajı ödülleri tarafından sağlanan fazla destek.
100mm tissue culture dish | BD Biosciences | 353003 | |
Precleaned frosted microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-343 | |
Sterile cell strainer, 70mm nylon mesh | Fisher Scientific | 22363548 | |
3mL syringe, Luer-Lok tip | BD | 309585 | |
Falcon 50mL polypropylene conical tube | Corning | 352098 | |
LIVE/DEAD fixable red dead cell stain kit | Life Technologies | L23102 | Life Technologies sells versions of this kit with different colors |
Fc Block | BD Biosciences | 553142 | |
16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | |
Normal rabbit serum | Sigma-Aldrich | R9133 | |
Anti-H3K4me1 antibody | Abcam | ab8895 | |
R-Phycoerythrin conjugation kit | Abcam | ab102919 | Alternatively, the LYNX rapid RPE kit from AbD Serotec can be used |