This article describes a method for generating a reproducible spinal cord compression injury (SCI) in the neonatal mouse. The model provides an advantageous platform for studying mechanisms of adaptive plasticity that underlie spontaneous functional recovery.
lésion de la moelle épinière (SCI) provoque généralement des déficits neurologiques dévastateurs, en particulier par des dommages aux fibres qui descendent du cerveau à la moelle épinière. Une zone actuelle majeur de la recherche se concentre sur les mécanismes de plasticité adaptative qui sous-tendent la récupération fonctionnelle spontanée ou induite suivant SCI. la récupération fonctionnelle spontanée est signalée comme plus tôt dans la vie, ce qui soulève des questions intéressantes sur la façon dont les changements de plasticité adaptative que la moelle épinière se développe. Pour faciliter la recherche de cette dynamique, nous avons développé un modèle SCI chez la souris néonatale. Le modèle présente un intérêt pédiatrique SCI, qui est trop peu étudié. Parce que la plasticité neuronale chez l'adulte implique certains des mêmes mécanismes que la plasticité neuronale dans la vie précoce 1, ce modèle peut potentiellement avoir une certaine pertinence aussi pour adultes SCI. Nous décrivons ici toute la procédure pour générer une blessure reproductible compression de la moelle épinière (SCC) chez la souris néonataledès postnatal (P) le jour 1. Le CCN est atteint en effectuant une laminectomie à un niveau spinal donné (ici décrit aux niveaux thoracique 9-11), puis en utilisant un Yasargil anévrisme mini-pince modifiée pour compresser et décompresser rapidement la moelle épinière . Comme décrit précédemment, les souris néonatales blessé peut être testé pour les déficits comportementaux ou sacrifiés pour une analyse ex vivo physiologique de la connectivité synaptique en utilisant des techniques d'enregistrement optique électrophysiologiques et à haut débit 1. Des études antérieures et en cours en utilisant l' évaluation comportementale et physiologique ont démontré une déficience dramatique, aiguë de hindlimb motilité suivie d'une récupération fonctionnelle complète dans les 2 semaines, et la première preuve de l' évolution des circuits fonctionnels au niveau des connexions synaptiques identifié descendant 1.
During the last decade, increasing evidence obtained from different spinal cord injury (SCI) models has shown that spinal networks can reorganize spontaneously to contribute to functional recovery1-9. Adaptive plasticity has as a consequence become an important topic in SCI research. It has been shown that plasticity encompasses regrowth of spared axons, sprouting of new axon collaterals and the formation of novel synaptic connections. Much of this knowledge has been obtained from behavioral or anatomical studies in adult animals. An important limitation of adult spinal cord studies is the difficulty of performing high-throughput physiological assessment, which is easier in neonatal preparations1. One major difference is that wholemount ex vivo preparations of the adult brainstem and spinal cord have low viability. Another is that adult spinal tissue is more opaque to light because it is thicker and myelinated. Although recent advances in in vivo imaging (see for example, 10-12) may partially overcome these problems, the possibility of performing high throughput imaging at any desired dorsoventral depth at multiple sites along a given brainstem-spinal cord preparation is currently only feasible in neonates. The immature state of axon myelination in the neonatal spinal cord facilitates high-throughput ex vivo optical recording, thus permitting a dynamic assessment of functional synaptic connections13-17. Combined with genetically encoded calcium reporters and optogenetic stimulation and pharmacology tools, optical approaches can contribute to a deeper understanding of the mechanisms underlying adaptive plasticity.
It is estimated that between 1-10% of all spinal cord injuries affect infants and children18-22. In contrast to adult SCI the pathogenesis and potential for spontaneous recovery in pediatric SCI is less studied. Using a neonatal SCI model can therefore provide more insight into pediatric SCI and contribute to a better understanding of the pathogenetic and recovery mechanisms involved. Moreover, post-SCI plasticity supporting functional recovery in the adult spinal cord is believed to involve at least in part the same mechanisms that govern the development of the central nervous system such as axon growth, branching and formation of new synapses23-26. Thus, using a neonatal SCI model could provide important insights into mechanisms that are also operative in the adult spinal cord, or that could potentially be reinstated in the adult spinal cord (for example by implantation of fetal cells or tissue or of tissue constructed de novo from pluripotent stem cells) to facilitate recovery.
The neonatal mouse thus provides a platform for an integrative, multi-methodological approach to investigating adaptive plasticity following spinal cord injury, in which a combination of behavioral, physiological, anatomical, molecular and genetic methods can be readily employed. Establishing standardized neonatal injury models is an important step in implementing such studies.
Dans cet article, les procédures pour un SCC blessures clip généré chez la souris P1 sont décrites. Les mêmes procédures peuvent également être effectuées à un stade ultérieur. Les blessures de compression ont été effectués avec succès à P5, P7, P9 et P12 (Züchner, et al., Manuscrit en préparation). À tous les stades postnataux, l'anesthésie générale est obtenue avec l'isoflurane vaporisé dans l'oxygène pur, mais le résultat anesthésique dépend fortement de l'âge. Dans des tentatives initiales de P1-P4, avant l'anesthésie locale a été introduit dans le protocole, il était difficile d'obtenir une sédation profonde et prolongée en raison d'une fenêtre étroite dose-effet entre la sédation insuffisante et un surdosage. En outre, les préoccupations liées à un effet neurotoxique de l' isoflurane chez les animaux nouveau – nés ont été soulevées 27-30. Une combinaison de l'isoflurane et les résultats anesthésique local bupivacaïne une anesthésie profonde et plus stable tout en permettant une réduction de la dose isoflurane par un facteur de 2-3. Différents types de anesthesia ont été décrits pour les rongeurs néonatals, y compris cryoanesthesia 31,32, mais un inconvénient potentiel de cryoanesthesia est son effet neuroprotecteur (examiné par 33,34), ce qui pourrait compliquer la génération d'une blessure efficace et reproductible. L' anesthésie à base de barbituriques est considéré comme ayant une efficacité moindre chez la souris néonatale due à des niveaux inférieurs de l' albumine sérique et la graisse corporelle que chez les adultes 35,36.
Bien que très invasive et traumatisante, une fois que la procédure est établie, le taux de mortalité au cours de la chirurgie est faible. Cependant, il y a des étapes critiques au cours de la procédure qui nécessitent une attention particulière pour améliorer la récupération et à la survie des souris exploités. Une question importante est de sélectionner les chiots qui auront les meilleures chances de survivre à la chirurgie. Lorsque la litière est grande l'état nutritionnel des chiots individuels varie. En plus du saignement qui se produit inévitablement lors de la chirurgie, les petits opérés passent heuress loin de la mère, et souvent ils ne boivent pas de lait avant le lendemain matin. Il est donc un avantage pour sélectionner les chiots qui ont déjà une certaine quantité de lait dans l'estomac. Ceci est facilement visible à travers la peau abdominale de P0 à P7.
Au cours de la première nuit du chiot exploité est à grand risque d'être cannibalisé par la mère. Au cours du développement initial de ce modèle plus de la moitié des souris opérés étaient absents le lendemain matin, avec des signes clairs de sang dans la cage. Nécrophagie, le cannibalisme et l' infanticide chez les rongeurs ont été étudiés depuis des décennies 37-40. Dans cette étude, le cannibalisme ne fut témoin une fois, mais il a été considéré comme une explication plus susceptibles que nécrophagie parce que les chiots qui ont été retournés à la cage étaient généralement en si bonne forme que la mort par des causes naturelles pendant la nuit semblait improbable. Cela a incité l'idée d'utiliser un agent pharmacologique réversible, comme le diazépam pour réduire l'anxiété et l'agressivité in la mère (revue par 41). l'injection intrapéritonéale de diazepam a grandement amélioré la situation, laissant tomber la mortalité au cours de la première nuit de plus de 60% à moins de 20%.
Réduire la taille des portées par l'abattage et de perturber la litière aussi peu que possible après le retour postopératoires sont des éléments supplémentaires qui peuvent bénéficier les animaux opérés. Toutefois, en laissant les chiots seulement exploités avec la mère est pas bénéfique. Le meilleur équilibre des chiots non opérés opérés / peut varier en fonction de la ligne, mais pour ICR et SCID-ICR souris quittant 4-5 chiots exploités (de blessures ou fictives) avec 3-4 chiots non opérés a donné les meilleurs résultats.
Dans un sens général, la limitation principale de ce modèle SCI néonatale est que la moelle épinière néonatale diffère à plusieurs égards de l'adulte, la moelle épinière et ne peuvent donc pas fournir des résultats expérimentaux qui sont comparables à celles obtenues à partir de modèles SCI adultes. De telles différences incluent la taille globale etvolume de la moelle épinière, le nombre de cellules, une sous-représentation des types de cellules spécifiques, telles que les oligodendrocytes immatures, des réponses immunitaires et les circuits de neurones immatures. Les conclusions tirées des expériences dans ce modèle doivent donc être considérées avec précaution. D'autre part, le modèle est pertinent pour le scénario relativement moins étudié pédiatrique SCI. En outre, la faiblesse apparente par rapport aux modèles SCI adultes est aussi une force potentielle car elle peut permettre à l'élucidation des mécanismes de plasticité qui, bien que peu existant dans la moelle épinière adulte, pourraient représenter un substrat thérapeutique si la réintégration. Il est concevable que le rétablissement des conditions néonatales ou même embryonnaires pourrait être mis en œuvre par l'implantation de cellules ou de tissus moins développés ou par traitement avec des réactifs qui engendrent le tissu adulte avec des caractéristiques antérieures de développement. En utilisant des enzymes pour éliminer les filets perineuronal est un exemple de cette dernière approche 42,43.
<p class="Jove_content"> Un problème majeur lors de l'établissement d'un modèle animal pour SCI est d'obtenir une blessure standardisée. Ceci est un aspect important qui a été abordé dans les modèles SCI multiples, par exemple, transection, hémisection, percuteurs, compression de ballon, écrasement forceps, compression du poids statique, etc. En ce qui concerne les dispositifs impact, les efforts dans ce sens ont abouti à des modèles SCI en rongeurs adultes où plusieurs paramètres de l'impact tels que la vitesse, la force et la durée peuvent être manipulés (examinés par 44). Une autre approche, impliquant moins d' équipement, emploie une modification de l'anévrisme de clip Kerr-Lougheed 45,46. Ces 2 approches sont complémentaires comme l'impacteur imite une blessure contusion alors que les imite clip a des blessures de compression avec un certain degré d'ischémie concurrente. En raison des contraintes de taille importante et une plus grande vulnérabilité des souris néonatales, la mortalité plus élevée associée à des interventions chirurgicales plus longues, ainsi que les coûts de develloppement des équipements à plus petite échelle, il a été choisi pour développer une compression du clip généré plutôt qu'une approche de contusion impacteur généré. Cela a été réalisé par l' adaptation d' un anévrisme mini-pince disponible dans le commerce pour tenir compte de la taille de la colonne vertébrale des souris néonatale 1. L'ajout d'un bouchon assure une largeur de compression normalisé, et aussi longtemps que la tension de la pince se comprime jusqu'à la limite de la butée, la force de compression pendant la phase statique à la largeur minimale devrait peu varier. Ce qui est non normalisé est la vitesse de la compression au cours de sa phase dynamique, étant donné que cela varie selon les variations de tension de clip au cours de sa durée de vie. Comme la phase statique de la compression dure beaucoup plus longtemps que la phase dynamique, et il y a peu de suggérer que le tissu de la moelle épinière exerce beaucoup d'un antagoniste contre les lames mini-clips, il est probable que la gravité des blessures est plus dépendante la phase statique. Ceci, cependant, reste à tester. Blessuregravité est susceptible de dépendre de nombreux facteurs, y compris la force statique de compression et de la durée, la vitesse de compression et de décompression, la position de la mini-pince, et le nombre de compressions réalisées sur le même site. Ainsi, la variation combinatoire de ces paramètres peut entraîner la génération d'un spectre de gravité des blessures de faible à sévère. Malgré le potentiel de la variabilité, dans notre étude publiée précédemment 1 , nous avons obtenu des résultats cohérents à histologique, les niveaux physiologiques et comportementaux, donc il y a peu de suggérer que la normalisation acceptable est difficile à réaliser. Nous notons que dans cette étude , nous avons utilisé plusieurs méthodes de validation à chaque niveau, y compris des tests de comportement tels que l' air pas à pas comme le montre la Figure 5.Dans ce modèle SCI néonatale la blessure épargne une certaine proportion des axones et fournit une situation favorable pour déclencher la plasticité adaptative par la re-Modelin ainsig de connexions épargnées et la formation de nouveaux circuits. De plus, puisque la souris néonatale est bien adapté aux fins d'enquête par de nombreuses méthodes expérimentales, il est possible d'utiliser ce modèle pour étudier la récupération fonctionnelle et la plasticité adaptative avec une approche intégrative, y compris des tests de comportement, le traçage axonal rétrograde et antérograde, immunohistochimie, électrophysiologie et haute enregistrement optique -throughput 1. A titre d'exemple, nous avons profité de cette approche intégrée pour démontrer réseau re-modélisation au niveau des entrées descendantes spécifiques en utilisant l' imagerie calcique à haut débit dans des préparations ex vivo wholemount du tronc cérébral et de la moelle épinière lésée 1. Cela peut être poussé plus loin en utilisant des outils de neuro-optogenetic et pharmacologie optogenetic pour évaluer le remodelage des connexions synaptiques entre des sous-populations spécifiques de neurones spinaux.
The authors have nothing to disclose.
This work has been supported by grants from the South-Eastern Norway Regional Health Authority (JLB, 2014119; JCG, project numbers 2015045 and 2012065), by the Norwegian Research Council (JCG, project number 23 00 00) and the University of Oslo.
Plastic seringe (30 or 50 mL) | |||
Plastic petri dish (150x25mm) | |||
Fortec isoflurane vaporizer | Cyprane | We use and old device out of production, check the link for newer device | |
Yasargil temporary aneurysm mini-clip | Æsculap | FE681K | |
Fine -Bore Polyethylene tubing ID 0.58mm, OD 0.96mm | Smiths Medical | 800/100/200 | |
Isoflurane (Forene) | Abbott GmbH & Co. KG | ||
Marcain (Bupivacain) | AstraZeneca | ||
Insuline seringe 0.3ml 30Gx8mm | VWR | 80086-442 | |
Ultra Fine Micro Knife 5mm cutting edge | Fine Science Tools | 10315-12 | |
Extra Fine Graefe Forceps – 0.5mm Tip | Fine Science Tools | 1153-10 | Not really necessary, often the teeth are too large |
Forceps SuperGrip Straight | Fine Science Tools | 00632-11 | Two forceps are necessary |
Spongostan Special 70 x 50 x 1 mm | Ferrosan | ||
Vannas Spring Scissors – 2mm Blades Straight | Fine Science Tools | 15000-03 | |
Vario Clip Applying Forceps | Aesculap | FE502T | |
Vicryl 6–0 (Ethicon) | Johnson and Johnson | J105G | |
Diethrich micro needle holder | 11-510-20 | ||
Temgesic (buprenorphine) | Schering-Plough | ||
Stesolid (diazepam) | Actavis | Also known as Valium | |
Pedamix | Fresenius Kabi | ||
Klorhexidinsprit (chlorhexidine gluconate) | Fresenius Kabi | D08A C02 |