Summary

Análise Filtro amostrado-Air para endotoxinas e conteúdo de DNA

Published: March 07, 2016
doi:

Summary

Two complementary analyses of atmospheric biological particles from air sampled filters are described herein: the extraction and detection of endotoxin, and of DNA.

Abstract

Aerosol Research Outdoor comumente utiliza partículas amostradas em filtros. Este procedimento permite que várias caracterizações das partículas recolhidas para ser realizado em paralelo. O objectivo do método aqui apresentado consiste em obter uma análise precisa e altamente fiável do conteúdo de endotoxina e de ADN de bio-aerossóis extraídos de filtros. A extracção de moléculas orgânicas de elevado peso molecular, tais como lipopolissacáridos, de filtros amostrados envolve a agitação da amostra, num meio à base de água livre de pirogénio. A subsequente análise baseia-se numa reacção enzimática que pode ser detectada utilizando uma medição turbidimétrica. Como resultado do elevado teor orgânico nos filtros da amostra, a extracção de ADN a partir de amostras é realizada usando um kit de extracção de DNA comercial que foi originalmente concebido para solos e modificados para melhorar o rendimento de ADN. A detecção e quantificação de espécies microbianas específicas usando Reacti cadeia da polimerase quantitativaem análise (Q-PCR) são descritos e comparados com outros métodos disponíveis.

Introduction

Amostragem de ar em filtros é uma ferramenta básica na investigação aerossóis atmosférica. 1 Os filtros são amostrados o ponto de partida para várias propriedades químicas, físicas e biológicas das caracterizações partículas ambiente recolhida. 2-11 A vantagem desta abordagem é que várias análises podem ser realizado fora de linha na mesma amostra. Compilando os dados de todas as diferentes análises permite ao pesquisador obter uma boa compreensão das características das partículas e auxiliares colhidos em resolver questões complexas nas ciências atmosféricas. 12,13 Por exemplo, aparelhos de ar amostras marinhas e fluviais tomada durante o mesmo período pode ser comparado com respeito à toxicidade de partículas amostrado e composição biológica. 14 para este estudo, lipopolissacáridos (LPS), componentes de células, as paredes bacterianas gram-negativas, também conhecidos como endotoxinas, foram extraídos a partir de filtros amostrados em terra e em um site para o interior, e foram avaliados usando olimulus amebócito lisado (LAL) de teste. Em paralelo, uma avaliação do conteúdo genómico bacteriano (bactérias totais, bactérias gram negativas, e cianobactérias) foi realizada na mesma amostra, utilizando a reacção em cadeia da polimerase quantitativa (Q-PCR). O teste LAL baseia-se em medições de turvação formada após a adição de um extracto aquoso de amebócitos do caranguejo-ferradura, Limulus polyphemus, a uma solução aquosa que contém as endotoxinas. Quanto maior for a concentração de endotoxinas na amostra, a turbidez mais rapidamente se desenvolve. 15 A análise Q-PCR baseia-se num sinal de fluorescência emitido como um fragmento de ADN específico é amplificado. 16 por monitorização em tempo real do sinal durante a fase exponencial da PCR reacção e de calibragem com uma curva padrão, a quantidade inicial de ADN pode ser quantificada. A combinação destas duas análises em conjunto com os outros, como detalhado em outra parte, 14 pode fornecer uma boa estimativa dos níveis de endotoxina e aquantidade de bactérias nas amostras de origem.

O objectivo do método aqui apresentado consiste em obter uma análise precisa e altamente fiável do conteúdo de endotoxina e de ADN de bio-aerossóis extraídos de filtros. Embora os métodos para a amostragem das características físico-químicas e inorgânicos dos aerossóis são bem conhecidos e, mais recentemente, têm sido desenvolvidos métodos para investigar a sua componente de matéria orgânica, 17 houve uma pesquisa escassa no componente biológico de aerossóis. 18 A razão para a corrente de método é preencher esta lacuna, apresentando em pormenor um método robusto para extrair, analisar e identificar a fração biológica de aerossóis 14.

O método detalhado aqui é esperado para encontrar uma ampla utilização em projectos de investigação biológicos interiores e exteriores de aerossol que envolvem a análise de filtro 20-24.

Protocol

Nota: Uma lista detalhada de todos os materiais e instrumentos utilizados neste protocolo é mostrado na seção Materiais. 1. Amostragem de Ar em filtros Preparação de Filtros Para a amostragem de alto volume, utilize 20,3 x 25,4 cm2 filtros. Escolha o tipo específico de filtro que melhor se adapta às necessidades de investigação, bem como o tamanho de corte do filtro, se for o caso. 1 Aqui, filtros de microfibra de uso de quartzo. f…

Representative Results

É comum para estudar aerossóis atmosféricos usando "off-line" análises de filtros amostra (ver Figura 2). Analisa 32 química do material incluem orgânico (por exemplo, proteínas, as moléculas de hidrocarboneto, sacáridos) e inorgânico (por exemplo, metais, sais) conteúdo amostrado . análises biológicas incluem conteúdo viáveis ​​e não viáveis ​​microrganismo, identificação de espécie utilizando uma aborda…

Discussion

Este trabalho descreve métodos de extração e detecção para quantificar tanto endotoxinas e DNA presente em amostras de aerossóis recolhidas em filtros. Os métodos requerem rotinas precisas e pode ser executada facilmente, desde que o experimentalista adere a alguns pontos essenciais e importantes discutidos aqui.

Para o passo de detecção de endotoxina, note que o lisado solução é bastante viscosa e tende a produzir bolhas mediante pipetagem. É difícil de remover ti bolhas, e el…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors thank Dr. Yoav Barak from the Chemistry Faculty, Weizmann Institute, for support and advice. This study was supported by the Israel Science Foundation (grant # 913/12), and by the Minerva Foundation with funding from the Federal German Ministry for Education and Research.

Materials

Filter sampling
HiVol 3000 – High Air Volume Sampler Ecotech
Quartz Microfiber Filters Whatman 1851-865 203mm X 254mm
ELF – Laboratory Chamber Furnaces Carbolite ELF 11series
Aluminum foil Opal
Name Company Catalog Number Comments
Endotoxin
Ethanol Sigma Aldrich 16368  Laboratory Reagent, 96%
Airstream Class II Biological Safety Cabinet AC-4E1 ESCO 10011712
Pyrotell -T Associates of Cape Cod, Inc. T0051
Control Standard Endotoxin Associates of Cape Cod, Inc. E0005-1 Escherichia coli O113:H10, 0.5 µg/vial 1 Pack
LAL Reagent Water Associates of Cape Cod, Inc. W0051
10 mL sterile syringe with Luer-Lok Tip Becton-Dickinson & Co. 309605
BD Precisionglide syringe needle Becton-Dickinson & Co. 305129 Sterile 
Parafilm-M sealing tape Parafilm P7543 Sigma catalog number
Microtubes Axigen MCT-200-C 2ml, pyrogen free
1.12 cm diameter Cork Borer Boekel Scientific 1601 BD Series – Steel Part of a cork borer set containing borers with various diameters. 
50 mm Petri Dish Miniplast Ein-Shemer 72050-01 Aseptic
Vortex Genie 2  Scientific Industries, inc. SI-0297
Microcentrifuge 5415 D Eppendorf 22621408
TC MicroWell 96 F SI w/lid Nunc 167008 Flat bottom wells (with lid (individually wrapped)), sterile, pyrogen free
Synergy HT Multi-Detection Microplate Reader Biotek 7091000
Name Company Catalog Number Comments
DNA
DNA away Sigma Aldrich 7010
Standard DNA of the microbial species of interest ATCC or other culture collection Either the appropriate microbial strain for DNA extraction or the extracted DNA
Neubauer-improved Marienfeld 640030 hemocytometer
TE buffer, Low EDTA Life Technologies 12090-015 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) 0.1 mM EDTA 
Nuclease-free PCR-grade water  Sigma Aldrich 3315959001
PCR primers Sigma Aldrich Targets the microbial species of interest
Dual-Labeled Probes Sigma Aldrich Targets the microbial species of interest
Screw cap tubes Axigen ST-200-SS 2 mL 
PowerSoil DNA extraction kit  Mo Bio Laboratories 12888-100
Glass beads, acid-washed 425-600 Microns Sigma Aldrich G8772-100G
Glass beads, acid-washed <106 microns Sigma Aldrich G4649-100G
PowerSoil Solution C1 Mo Bio Laboratories 12888-100-1 Cell lysis buffer , Power soil Kit
Magic Touch ice bucket Bel-Art 18848-4001
Mini-Beadbeater-16 BioSpec 607EUR
StepOnePlus Real-Time PCR System Applied Biosystems 4376600
Fast SYBR Green Master Mix Applied Biosystems 4385612
TaqMan Gene Expression Master Mix Applied Biosystems 4370048
MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode, 0.1 mL Applied Biosystems 4346906
MicroAmp Splash-Free 96-Well Base Applied Biosystems 4312063
MicroAmp Optical Adhesive Film Applied Biosystems 4311971
Centrifuge 5810 R Eppendorf 5811 000.010 Rotor A-4-62 with MTP buckets 

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Cite This Article
Lang-Yona, N., Mazar, Y., Pardo, M., Rudich, Y. Air-sampled Filter Analysis for Endotoxins and DNA Content. J. Vis. Exp. (109), e53444, doi:10.3791/53444 (2016).

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