The molecular mechanisms of the decondensation of highly compacted mitotic chromatin are ill-defined. We present a cell-free assay based on mitotic chromatin clusters isolated from HeLa cells and Xenopus laevis egg extract that faithfully reconstitutes the decondensation process in vitro.
During the vertebrate cell cycle chromatin undergoes extensive structural and functional changes. Upon mitotic entry, it massively condenses into rod shaped chromosomes which are moved individually by the mitotic spindle apparatus. Mitotic chromatin condensation yields chromosomes compacted fifty-fold denser as in interphase. During exit from mitosis, chromosomes have to re-establish their functional interphase state, which is enclosed by a nuclear envelope and is competent for replication and transcription. The decondensation process is morphologically well described, but in molecular terms poorly understood: We lack knowledge about the underlying molecular events and to a large extent the factors involved as well as their regulation. We describe here a cell-free system that faithfully recapitulates chromatin decondensation in vitro, based on mitotic chromatin clusters purified from synchronized HeLa cells and X. laevis egg extract. Our cell-free system provides an important tool for further molecular characterization of chromatin decondensation and its co-ordination with processes simultaneously occurring during mitotic exit such as nuclear envelope and pore complex re-assembly.
תמצית ביצת laevis Xenopus היא כלי רב עוצמה ומיושם באופן נרחב כדי ללמוד אירועים הסלולר מסובכים בפשטות של assay תא ללא. מאז התיאור הראשון שלהם על ידי Lohka & 1 Masui הם כבר בשימוש נרחב ללמוד תהליכי mitotic כגון הכרומטין עיבוי 2, הרכבה ציר 3, התמוטטות מעטפת גרעין 4, אלא גם תחבורת nucleocytoplasmic 5 או DNA שכפול 6. אירועים המתרחשים בסוף מיטוזה, הכרחיים להרפורמציה של גרעין interphasic כגון הרפורמציה מעטפת גרעין והרכבה מחדש מורכבת נקבובית הגרעיני הם הרבה פחות מובנים בהשוואה לאירועי mitotic המוקדמים אך ניתן ללמוד באופן דומה באמצעות תמצית ביצת צפרדעי 7. יש לנו לאחרונה הוקם assay המבוסס על תמצית ביצת צפרדעים ללמוד decondensation הכרומטין בסוף מיטוזה 8, תהליך נחקר תחת שמחכה ליTS אפיון מפורט.
בmetazoans, הכרומטין מרוכז מאוד בכניסה mitotic על מנת לבצע בנאמנות הפרדה של החומר הגנטי. כדי להבטיח שהכרומטין נגיש לביטוי גנים ושכפול ה- DNA במהלך שלבי הביניים, זה צריך להיות דה-נדחס בסוף מיטוזה. בבעלי חוליות, הכרומטין הוא עד חמישים ולקפל יותר דחוס במיטוזה לעומת הביניים 9, בניגוד לשמרים שבו דחיסת mitotic היא בדרך כלל נמוכה בהרבה, למשל, כפול רק בס cerevisiae 10. decondensation הכרומטין חוליות כבר למד בעיקר בהקשר של ארגון מחדש DNA הזרע לאחר הפריית ביצית. מנגנון מולקולרי, שבי nucleoplasmin, חלבון ביצית בשפע, מחליף protamines זרע ספציפי לH2A ההיסטונים וH2B מאוחסן בביצה. תהליך זה גם הובהר באמצעות תמצית Xenopus ביצת 11, 12. עם זאת, הביטוישל nucleoplasmin מוגבל לביציות 13 והכרומטין mitotic אינו מכיל protamines הזרע ספציפי אלה. לכן הכרומטין decondensation בסוף מיטוזה הוא nucleoplasmin עצמאי 8.
במבחנת התגובה decondensation אנו מעסיקים תמצית המופקת מהביצים מופעלות X. laevis ואשכולות הכרומטין המבודדים מתאי הלה מסונכרנים. טיפול בביצים עם ionophore סידן מחקה את שחרור סידן לתוך הביצית שנוצרה על ידי כניסת זרע במהלך הפריה. גל סידן גורם לחידוש מחזור התא והביצה, נעצר בmetaphase השני של המיוזה, התקדמות לשלבי הביניים הראשונים 14. לכן, תמציות ביצה מוכנות ביצי צורה מופעלת לייצג את מדינת יציאה / הביניים mitotic ומוכשרים כדי לגרום לאירועים ספציפיים ליציאת mitotic כמו decondensation הכרומטין, מעטפת גרעין ולהתעמק הרפורמציה מורכבת. לבידוד של CH mitoticromatin אשכולות השתמשנו גרסה מעט שונה של הפרוטוקול שפורסם על ידי גאסר וLaemmli 15, שבו אשכולות כרומוזום פורסמו על ידי תמוגה מתאי הלה מסונכרן במיטוזה ומבודדת במאגרים המכיל polyamine ידי centrifugations שיפוע.
Xenopus laevis תמציות ביצה הן כלי שימושי מאוד לשחזר בנאמנות תהליכים תאיים במבחנה, ומערכת זו שימשה בהצלחה באפיון של אירועי מחזור התא וחלוקת תא 2, 3,5,6,17. בשל חנויות גדולות של רכיבים גרעיניים מוחרם בביצה במהלך oogenesis, תמציות ביצה הן מקור מצוין של מרכיבים תאי?…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי קרן המחקר הגרמנית וERC (AN377 / 3-2 ו309,528 CHROMDECON לWA) ומלגת דוקטורט של Boehringer Ingelheim חטיבות לAKS איור 1 & 2 הם נדפסו מתא התפתחותית 31 (3), Magalska et al., פונקצית ATPases כמו-RuvB בdecondensation הכרומטין בסוף מיטוזה, 305-318, 2014, באישור סוג מElsevier.
spermine tetrahydrochloride | Fluka analytical | 85610-25G | |
spermidine trihydrochloride | Sigma | S2501-5G | |
high-purity digitonin | Millipore | 300410-1GM | toxic |
PMSF | Applichem | A0999,0100 | toxic |
thymidine | Calbiochem | 6060 | |
nocodazole | Calbiochem | 487928 | toxic |
37 % formaldehyde solution | Roth | 7398-1 | toxic |
trypan blue solution (0.4%) | Sigma | T8154 | toxic |
1,4-dithiothreitol (DTT) | Roth | 6908.2 | |
AEBSF hydrochloride | Applichem | A1421,0001 | |
pepstatin | Roth | 2936.1/2/3 | |
leupeptin | Roth | CN334 | |
aprotinin | Roth | A162.3 | |
Percoll (colloidal silica particles solution) | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
glutamine | Gibco | 25030-024 | |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
75 cm² tissue culture flasks | Greiner Bio-one | 658175 | |
heat-inactivated fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10500-064 | |
Homogenizer (40 mL tissue grinder) | Wheaton | 357546 | |
Neubauer chamber | Assistent | 441/1 | |
Oak Ridge Centrifuge Tubes, polycarbonate (50 ml) | Nalgene | 3118-0050 | |
100 µm cell strainer, nylon | BD Falcon | 352360 | |
cytochalasin B | Applichem | A7657,0010 | toxic |
cycloheximide | Roth | 8682.3 | toxic |
L-cystein | Merck | 1,028,381,000 | |
hCG available as Ovogest | MSD | 1431593 | |
PMSG available as Intergonan | MSD | 1431015 | |
A23187 (mixed calcium-magnesium-salt) | Enzo | ALX-450-002-M010 | toxic |
syringe needles (1.20 x 40 mm, 18 G x 1 1/2") | Braun | 4665120 | |
ATP | Serva | 10920.03 | |
GTP, 2 Na x 3 H20 | Roth | K056.1/2/3/4 | |
creatine phosphat disodium salt | Calbiochem | 2380 | |
creatine phosphokinase | Sigma | C3755-35KU | |
DMAP | Sigma | D2629-1G | |
DAPI | Roche | 10236276001 | |
PFA | Sigma | P-6148 | toxic |
centrifugation tubes for TLA 100 (7 x 10 mm, 5/16 x 13/16 in.) | Beckman Coulter | 343775 | |
"Cell-Saver" (tips with wide opening, 1000 µL) | Biozym | 729065 | |
50 % glutaraldehyde solution, grade I | Sigma alderich | G7651-10 mL | toxic |
0.1 % (w/v) poly-L-lysine solution | Sigma | P8920-100 mL | |
flat-bottom tubes (6 mL, 16.0/55 mm) | Greiner Bio-one | 145211 | |
Vectashield mounting medium | Vector laboratories | H1000 | |
tubes for TLA120 (11 x 34 mm, 7/16 x 1 3/8 in.) | Beckman Coulter | 343778 | |
"Cell-Saver" (tips with wide opening, 200 µL) | Biozym | 729055 | |
12 mm coverslips | Thermo Scientific | 0784 #1 |