Isolement des cellules de Sertoli et péritubulaire cellules de rat Testicules
Summary
les cellules de Sertoli primaire sont nécessaires pour étudier privilège des testicules-immune, la transduction du signal lors d'une inflammation ou une infection, et l'utilisation de leurs propriétés immunoprotection. Nous décrivons ici un protocole à base d'enzymes pour l'isolement des cellules de Sertoli primaires hautement purifiées et les cellules péritubulaires de testicules de rat.
Abstract
Le testicule, et en particulier le gamète mâle, remet en question le système immunitaire d'une manière unique, car le sperme différenciés apparaissent d'abord au moment de la puberté – plus de dix ans après la création de la tolérance immunitaire systémique. cellules spermatogènes expriment un certain nombre de protéines qui peuvent être considérées comme non-soi par le système immunitaire. Le testicule doit alors être en mesure d'établir la tolérance à ces néo-antigènes d'une part, mais encore être en mesure de se protéger contre les infections et le développement de tumeurs, d'autre part. Par conséquent, le testicule est l'un des quelques sites privilégiés immunitaire dans le corps qui tolèrent des antigènes étrangers sans évoquer une réponse immunitaire inflammatoire préjudiciable. les cellules de Sertoli jouent un rôle clé pour le maintien de cet environnement privilégié immunitaire du testicule et prolongent également la survie des cellules cotransplanted dans un environnement étranger. Donc les cellules de Sertoli primaires sont un outil important pour étudier le privilège immunitaire du testicule qui ne peut être easily remplacés par des lignées cellulaires établies ou d'autres modèles cellulaires. Nous présentons ici un protocole détaillé et complet pour l'isolement des cellules de Sertoli – et les cellules péri-tubulaires si on le souhaite – de testicules de rats en un seul jour.
Introduction
Testicules produisent des gamètes mâles et les hormones sexuelles, à savoir, les androgènes. L'organe est composé de deux compartiments. Dans le compartiment interstitiel, qui représente environ 10-12% du volume testiculaire totale 1, stéroïdogenèse a lieu dans les cellules de Leydig. Le compartiment tubulaire représente environ 60 à 80% du volume des testicules 1 et contient des cellules germinatives et les deux types de cellules somatiques – cellules de Sertoli et des cellules péritubulaires. Le testicule est divisé par des cloisons de tissu conjonctif en 250-300 lobules, contenant chacun 1-3 tubes séminifères hautement complexe. Ces tubes sont entourés par une membrane basale, une feuille de collagène et une couche circonférentielle de cellules péritubulaires (Figure 1A).
L'épithélium germinatif est situé sur la face luminale de la membrane basale. Les cellules de Sertoli sont de grandes cellules allongées qui couvrent l'ensemble épithélium germinatif de la membrane basale à la lumière. Ils sont fortement attfaisait mal à la membrane basale et former une feuille cellulaire continue à travers les jonctions serrées qui obture organisés basolatérale de l'épithélium germinatif de l'interstitium et représente la barrière hémato-testiculaire. les cellules de Sertoli ont des projections et des ramifications qui leur permettent d'entrer en contact morphologique et fonctionnelle étroite avec un nombre spécifique de l'espèce, mais constante, des cellules germinales cytoplasmiques éminents. cellules souches germinales diploïdes prolifèrent et se différencient en spermatogonies.
Au cours de la méiose I courte durée spermatocytes tétraploïdes sont générés qui développent en quatre spermatides haploïdes pendant la méiose II. Toutes les cellules germinales sont reliés entre eux par des ponts cytoplasmiques de sorte qu'ils forment un réseau cellulaire. Le principal événement pendant la maturation des spermatides est l'extrusion d'une grande partie du cytoplasme, formant corps résiduels, dans un processus appelé spermiogenèse. corps résiduels sont phagocytés par les cellules de Sertoli. spermatides tardifs sont ensuite libérés dansla lumière tubulaire et transportés dans l'épididyme en outre pour la maturation. Les cellules de Sertoli et les cellules germinales apparaissent à coordonner mutuellement spermatogenèse topographiquement et fonctionnellement.
Préparation de types de cellules testiculaires individuels a commencé il y a presque un siècle, lorsque de petits morceaux testiculaires ont été cultivées et types de cellules identifiées par microscopie 2. Par dissection minutieuse des tubules après l'ouverture de la tunique albuginée aide d'une pince à pointe fine, il a été plus tard possible de séparer tubulaire et compartiments interstitiels 3. En 1975, Welsh et Wiebe introduit un traitement à la collagénase afin de libérer les tubes d'adhérer tissu interstitiel et un traitement de pancréatine pour l'enlèvement de la couche de cellules péri-tubulaire externe 4. Dès le début de jeunes rats immatures (environ 20 jours old) avaient été utilisées dans laquelle les cellules de Sertoli comprennent une fraction importante de la population des cellules tubulaires parce spermatogenèse n'a pas encore commencé. A ce Sert de rat d'âgeoli cellules cessent de se diviser et de jonctions serrées entre les cellules voisines afin de former la barrière hémato-testiculaire est établi 5.
Indépendant de Welsh et Wiebe Dorrington et al. Introduit une combinaison de la trypsine et deoxyribonuclease suivie par l'inhibiteur de la trypsine soybeen et le traitement de la collagénase qui a été publié dans la même année 6. Les deux groupes ont également utilisé la force mécanique (étirage des fragments digérés tubulaires à plusieurs reprises à travers une aiguille de seringue ou une pipette Pasteur, respectivement) afin de produire une suspension de cellules homogène pour électrodéposition qui contient environ 70% de cellules de Sertoli. Après 3 jours de culture, en utilisant un milieu exempt de sérum, le pourcentage de cellules de Sertoli augmente à environ 90%. Cela pourrait être en grande partie attribuée à la mort de contaminer les cellules germinales. cellules péri-tubulaires résiduelles (PTC), cependant, restent fermement attachés via leur matrice extracellulaire. PTC, mais pas les cellules de Sertoli, sont connus pour produirela fibronectine qui peut servir en tant que protéine marqueur pour estimer la contamination par PTC. Par conséquent, Tung et al. raisonnement selon lequel un traitement par la hyaluronidase pourrait supplémentaire d'améliorer la pureté de la fraction des cellules de Sertoli 7. En effet, ils ont pu montrer que un traitement supplémentaire était en mesure de réduire la contamination par PTC environ 20 fois, ce qui devient particulièrement évident quand en comparaison d'un milieu contenant du sérum est utilisé pour cultiver des cellules de Sertoli purifiés. Dès lors la procédure améliorée de Tung et al. est devenu le protocole en vigueur et a été largement utilisé par les autres grands groupes dans le domaine de 8 (figure 1B).
Au cours du traitement par la collagénase la majorité des PTC sont libérés et peuvent être isolés en parallèle à des cellules de Sertoli. Tandis que les CTP prolifèrent vigoureusement et ne répondent pas à l'hormone folliculo-stimulante (FSH), les cellules de Sertoli ne subissent pas plus la mitose et de répondre à la FSH par des changements morphologiques caractéristiqueset une augmentation de l'adénosine monophosphate cyclique (AMPc) Concentration 9. Protocoles très similaires de digestion enzymatique peuvent être utilisés pour l'isolement des cellules de Sertoli primaires des autres animaux comme l'homme 10, souris 11,12, hamster sibérien 13 ou 14 yak. Pour l'élimination de grandes quantités de contaminer les cellules germinales un choc hypotonique peut être utilisé à la fin de la procédure d'isolement 15. Ceci permet également l'isolement efficace des cellules de Sertoli de rat adulte 16 testicules. Une suspension de cellules de Sertoli enrichi peut également être séparée à partir de cellules germinales en étalant la suspension sur des boîtes revêtues de lectine agglutinine Datura stramonium 17. Seules les cellules de Sertoli et quelques PTC résiduels adhèrent aux plaques de lectine.
des cultures de cellules de Sertoli primaires, principalement du rat, ont été utilisées initialement pour étudier la réactivité aux hormones ou d'établir des lignées cellulaires telles que la cellule de Sertoli de souris line TM4 18. Cette lignée cellulaire a été étudié dans plus d'une centaine d'études jusqu'à aujourd'hui. Dans une approche translationnelle cellules de Sertoli ont été utilisés pour les immuno-protection des cellules et des tissus comme dans la co-transplantation d'îlots pancréatiques xénogreffes ou allogéniques pour la survie du greffon à long terme co-cultivées sans immunosuppression systémique 19. Les cellules de Sertoli isolées ont également été utilisés dans des expériences de co-culture pour étudier épithéliale-mésenchymateuses (cellules de Sertoli – CFC) et les cellules somatiques de germe (cellules de Sertoli – cellules germinales) Interactions 20, 21. Les cellules de Sertoli récemment primaires ont été utilisés pour étudier l'expression des récepteurs de type Toll et la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires ainsi que les cascades de transduction du signal conduisant à l'expression des cytokines après une infection par non pathogène et uropathogènes E. 22 coli. D'autres études récentes ont utilisé des cellules de Sertoli pour étudier p immunitaire testiculaire23 rivilege et montré que la testostérone pré-traitement supprime la réponse inflammatoire induite par LPS 24.
Protocol
Representative Results
Discussion
The seminiferous tubules are bounded by a circular layer of peritubular cells and a basal lamina on the luminal side. Sertoli cells are resting on the basal lamina, establish the blood testis barrier through formation of occluding junctions between adjacent cells and provide the structural framework for the organisation of the seminiferous epithelium. Sertoli cells and adjacent spermatogenic cells maintain intimate contacts throughout germ cell development providing physical contact and communication alike. Therefore, wh…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier Guido Verhoeven et Ludo Deboel, Louvain, qui a été extrêmement utile dans l'établissement de l'isolement des cellules de Sertoli primaires dans le laboratoire Meinhardt à Giessen. Monika Fijak, Gießen, est reconnu pour son aide à la figure 1A et des conseils. Des études ont été pris en charge par la Deutsche Forschungsgemeinschaft travers subvention BH 93 / 1-1 (SB) et le financement du College Graduate Research JLU Gießen International (Allemagne) / Université Monash (Melbourne, Australie) GRK 1871 (SB). Un soutien a également obtenu à partir d'une subvention de l'État de Hesse dans le programme "Landes-offensive zur Entwicklung Wissenschaftlich-ökonomischer Exzellenz" (LOEWE) appelé "Männliche Infertilität bei Infektion & Entzündung" (MIBIE).
Materials
| Actin (smooth muscle) antibody clone 1A4 | Dako | M0851 | Monoclonal mouse anti human antibody. Use 1:100 dilution for immunofluorescence. |
| Albumin bovine fraction V Standard grade, lyophilized |
Serva | 11930.04 | Filter (0.45 µm) BSA solutions used for immunofluorescence. |
| Corning™ Cell Strainers 70 µm | Corning | 431751 | White color |
| Collagenase A from Clostridium histolyticum | Roche | 10103586001 | |
| DAPI mountant ProLong® Gold Antifade | Life technologies | P-36931 | |
| D-glucose | Sigma | G8644 | 100 g/l |
| Dulbecco´s PBS without Ca2+/Mg2+ | Gibco | 14190-094 | |
| DNase I | Roche | 10104159001 | |
| Electron microscope | Zeiss | EM 109S | |
| Fluorescence microscope | Zeiss | Axioplan 2 | |
| Hyaluronidase from bovine testis | Sigma | H3506 | |
| Inverted light microscope | Olympus | CKX41 | Routine cell culture microscope |
| Mouse IgG / IgM (H+L) polyclonal secondary Antibody |
Life technologies | A-10684 | Alexa Fluor® 488 conjugate |
| Oil Red O | Sigma | O0625 | Has replaced Sudan III and Sudan IV because of brighter color. |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Penicillin (5,000 U/ml)/ Streptomycin (5,000 µg/ml) |
Gibco | 15070-063 | 100x solution |
| RPMI-1640 | Gibco | 21875-034 | Contains 300 mg/L L-glutamine |
| Trypsin from porcine pancreas | Sigma | T5266 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Trypsin inhibitor from soybean | Sigma | T6522 | The Sigma product is considerably cheaper than the previously used BPTI (Aprotinin) from Roche. |
| Vimentin antibody (V9) | Sigma | V6630 | Monoclonal mouse anti pig vimentin antibody. Use 1:100 dilution for immunofluorescence. |
| Wistar WU rats | Charles River | N/A | Should be 19 days old on day of experiment. |
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