레이저 유도 신경 세포의 추적에서 뇌 외식
Summary
우리는 체외 준비를 사용하여 뇌의 핵에 선행 성 또는 역행 추적 주사를 통해 신경 세포와 그 프로세스 레이블을하는 기술에 대해 설명합니다. 우리는 내가 N 표시 정확도를 높이기 위해 유리의 형광 표지 된 마우스 돌연변이 및 기본 광학 기기를 복용하여 추적 전기를 체외의 기존 방법을 수정했습니다.
Abstract
우리는 과정 중에 타겟 레이저 조명 및 매칭 필터 고글 뇌 절편에서 전기 천공을 통하여 염료 흡수를 증가시키기 위해 전기적 및 압력 펄스의 시리즈를 사용하여 시험 관내 트레이서 주입 프로토콜을 결합하는 기술을 제시한다. 그 자체로 체외 전기의 기술 기술은 뇌의 특정 지역을 타겟팅에 대한 상대적으로 좋은 시각 제어를 얻을 수 있습니다. 레이저 형광 유전자 마커의 자극과 판독 대역 통과 필터 고글을 통해, 유전자 표지 세포 / 핵 및 형광 추적 염료의 배출을 선택할 수있는 연구자가 실질적으로 주사의 정확도를 높일 수 있습니다과 결합하여 관심 영역을 발견하고 더욱 효율적으로 주입 영역에서 염료 확산 / 흡수를 위해 제어함으로써. 또한, 레이저 조사에 의한 방법은 잠 neurocircuit 소정의 기능을 연구 할 수 있도록GFP 발현이 신경 세포의 개체군에 의해 표현 송신기의 유형에 연결된 경우에 소정 영역에 돌출 뉴런의 유형에 대한 정보를 iding.
Introduction
특정 신경 (마이크로) 회로를 정의하기 위해, 상기 하나의 회로는, 자신의 접속 패턴의 다양한 참여자를 발견함으로써 시작한다. 이제까지의 lesioning 1을 통해 신경 해부학 추적 기술의 큰 다양성을 추적 neurofiber에 대한 월러의 게시가 설립되었습니다입니다. 1,971 5-6 발견으로 이들 기술 중 일부는 고정 된 조직 사후 2-4에 적용 할 수있는, 다른 라이브 뉴런 염료의 활성 전송에 의존한다. 후자는 또한 (주어진 돌기의 근원, 즉에 주입 영역으로부터. 면적 상기 돌출되는 뉴런 인 somata) 활성 역행 활용 방법을 구별 두 그룹으로 분할 될 수 있고, 활성 선행 성 (주입로를 주어진 투사의 대상, 즉. 축삭 돌기 및 레이블 뉴런) 수송의 축삭 터미널 지역. 또한, 어떤 경우에는 TRACER 재료는 다음 다른 경우에는 외식 뇌가 주입하는 동안, (생체 내 추적 주사에) 몇 일 또는 몇 주에 의해 주입을 생존과 인공 뇌척수액에 주입 후 몇 시간 동안 품어 살아있는 동물에 주입 (체외 추적 주사) .
이 프로토콜에서 우리는 생체 전기 기술 7-8에서 기존의 추적 물질로 choleratoxin 서브 유닛-B 및 테트라 메틸 덱스 트란을 이용하여 선행 성 및 역행 추적 실험에서 신경 세포 인 somata과 프로세스 레이블을 수정했습니다. 이 프로토콜의 전반적인 목적은 탐침 주사 중에 타겟팅 정확성을 향상시키기 위해 사용할 트랜스 제닉 마우스 선 및 기본적인 광학 기기를 이용하면서, 다른 뇌 핵 사이의 연결의 연결 패턴을 추적하는 효율적인 도구 신경 과학자를 제공하는 것이다. 선행 성 및 역 행성 추적의 방법을 사용하여 비록choleratoxin 및 덱스 트란 아민과 각각의 형광 표지 된 접합체는 9-13 새로운 것이 아니다 (예. 하스 등 전기의 방법 때문이다. 14), 뇌 조직의 블록을 포함하는 체외 준비에 전기와 추적 주사의 조합 보다 최근의 개발 7이다. 살아있는 동물에 추적 염료의 동일 유형을 사용하여 신경 세포의 추적 기술을 통해 그 주요 장점 때문에 일렉트로 염료 뉴런에 의해 흡수되고있는 더 높은 효율, 증가 된 표지의 강도이다. 실험자 주입 대상 영역 위에 시각적 컨트롤을 가지고 있기 때문에 추가적인 장점은, 트레이서 주입시 (염료 전송 요구)을 단축 잠복기 및 증가 된 정확성을 대상이다. 후자는 또한 고가의 장비가 정위 관심 핵 또는 뇌 영역을 찾기 위해 필요하지 않다는 것을 의미한다.
ADDI으로레이 터는 우리는 405 nm의 파장과 일치하는 대역 통과 필터링 고글 휴대용 레이저 포인터 (450 이루어진 뉴런 (15)와 기본적인 광학 기기의 그 글라이신 개체군에서 GFP를 발현하는 트랜스 제닉 마우스 라인 이용했고, 정확도를 목표로 증가 – 700 ㎚). 따라서, 우리는 형광 신호를 통해 주입 영역을 식별함으로써 정확도를 타겟팅 및 토착 GFP 신호와 탐침 사이의 상호 작용의 관찰을 통해 주입 지역 내의 염료 확산을위한 제어 미세한 방법을 제공하여 상당한 추가적인 증가를 달성 형광. 우리의 기술은 추적 가득 차 있었다 (다른 마우스 라인 또는 흥분성)의 GFP 양성 억제 신경 세포를 식별하여 연결과 함께 회로의 기능을 발견 할 수 있습니다.
요약하면, 우리는 또한 척추 동물의 뇌의 커 넥톰을 공부하고 T를 평가하기 위해 강력한 신경 과학적 도구를 강화그는 주어진 neurocircuit의 다른 신경 해부학 적 특징. 저렴하고 널리 사용되는 광학 장비와 함께 형질 전환 마우스를 사용하여 우리는 크게 우리의 주사의 대상으로 정확도를 높일 수 있었다. 또한, 트랜스 제닉 마우스는 청각 뇌간에서 억제 저항기의 기능을 밝혀 도움 추적 접속의 타입을 식별하라고시켰다.
Protocol
Representative Results
Discussion
, 생체 내 추적 연구에 반대 체외 추적 전기의 일반적인 강도는 고가의 정위 (종종 전기 생리학) 장비를 포함하지 않는, 그것은 연구자에게 따라서 관심과의 뇌 영역에 더 접근 할 수 있다는 것입니다. 덱스 트란 아민 및 다른 트레이서의 사용에 대한 상세한 검토를 참조 (생체 트레이서 주사의 경우가 아닌 일 또는 주 – 또한, 뇌 이식편 필요한 생존 기간은 몇 시간 (4 일)에 걸쳐…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NIH 지원 / NIDCD R01 DC 011582. 이미징 실험은 콜로라도 앤 슈츠 의료 캠퍼스 고급 광학 현미경 코어의 대학에서 수행 하였다는 NIH / NCRR 콜로라도 CTSI 허가 번호 UL1 RR025780과 록키 마운틴 Neurlogical 장애 코어 센터 보조금 NIH P30NS048154에 의해 부분적으로 지원. 솔크 연구소에서 박사 샤샤 뒤 락은 GlyT2-GFP 마우스를 우리에게 제공했다.
Materials
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | All chemicals are from Sigma-Aldrich, unless noted otherwise. |
| Potassium chloride | P9333 | ||
| Potassium phosphate monobasic | P5655 | ||
| Sodium phosphate di-basic | S907 | ||
| Magnesium chloride | M2670 | ||
| Calcium chloride | C5080 | ||
| Glucose | G7528 | ||
| Sodium bicarbonate | S6297 | ||
| Ascorbic acid | A4544 | ||
| Myo-inositol | I5125 | ||
| Sodium pyruvate | P2256 | ||
| Bovine serum albumine | A2153 | optional, for additional (immuno)histochemistry | |
| Triton-X-100 | X100 | optional, for additional (immuno)histochemistry | |
| Poly(ethylene glycol), 8000 MW | P2139 | optional, for brain clearing | |
| Formamide | Fisher Scientific | F84 | optional, for brain clearing |
| Choleratoxin subunit-b | Molecular Probes | C-34776 (Alexa 555) | |
| Dextrane tetramethyl-rhodamine | Molecular Probes | D-7162 (Alexa 555) | |
| Fluorescent Nissl | Invitrogen | N-21479 (blue) | optional |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | SF93 | |
| Agarose | Invitrogen | 16520 | |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Pentobarbi-tal | Vortech Pharmaceuticals | Fatal-Plus | |
| Borosilicate glass filaments | Harvard Apparatus | G150F-10 | |
| Pipette puller | Zeitz Instruments, Germany | DMZ Universal Puller | |
| Perfusion setup | Custom-made | ||
| Laser pointer | laserpointerpro.com, Hong Kong | HK-88007294 (405 nm) | |
| Filter/safety goggles | Dragon Lasers, China | LSG09 (band-pass 450-700 nm) | |
| Bionocular microscope | Wild Heerbrugg, Switzerland | Wild M3 | Equipped with high-intensity illuminator (MI-150; Dolan-Jenner Inc.) |
| Picospritzer | Parker Instruments | Picospritzer III | |
| PC with installed MC Stimulus software | Multi Channel Sys-tems, Germany (software) | ||
| 2-channel stimulator | Multi Channel Sys-tems, Germany | STG-1002 | |
| Stimulation isolation unit | A.M.P.I., Israel | Iso-Flex | |
| Micromanipulator | Narishige, Japan | YOU-1 | |
| Vibratome | Leica, Germany | VT1000S |
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