Intracellular Ca2+ remodeling in aging may contribute to excitotoxicity and neuron damage, processes mediated by Ca2+ overload. We aimed at investigating Ca2+ remodeling in the aging brain using fluorescence and bioluminescence imaging of cytosolic and mitochondrial Ca2+ in long-term cultures of rat hippocampal neurons, a model of neuronal aging.
Suscettibilità alla morte cellulare dei neuroni associati alla neurodegenerazione e ischemia sono estremamente aumentata nel cervello invecchiato ma meccanismi responsabili sono mal noti. Eccitotossicità, un processo che si ritiene di contribuire al danno dei neuroni indotta da entrambe le ingiurie, è mediata da attivazione dei recettori del glutammato che promuove Ca 2+ afflusso e mitocondriale sovraccarico di Ca 2+. Un cambiamento sostanziale intracellulare di Ca 2+ omeostasi o ristrutturazione di Ca2 + intracellulare omeostasi può favorire danno neuroni in vecchi neuroni. Per indagare Ca 2+ rimodellamento nell'invecchiamento abbiamo usato l'imaging cellulare dal vivo in colture a lungo termine di neuroni di ratto dell'ippocampo che assomigliano per alcuni aspetti neuroni in vivo di età. Per questo fine, cellule dell'ippocampo sono, in primo luogo, al momento disperso dalle nuove ippocampi di ratto nato e placcato su vetrini rivestiti, vetro poli-D-lisina. Poi culture sono tenuti in media controllati per diversi giorni o più weeks per indagare giovani e vecchi neuroni, rispettivamente. In secondo luogo, neuroni in coltura sono caricati con fura2 e sottoposti a misure di concentrazione citoplasmatica di Ca 2+ utilizzando digitale rapporto imaging di fluorescenza. In terzo luogo, neuroni in coltura sono trasfettate con plasmidi che esprimono un tandem di bassa affinità equorina e GFP mirata ai mitocondri. Dopo 24 ore, equorina all'interno delle cellule viene ricostituito con coelenterazine e neuroni sono sottoposti ad immagini bioluminescenza per il monitoraggio della concentrazione di Ca2 + mitocondriale. Questa procedura in tre fasi permette di monitorare citosolica e mitocondriale Ca 2+ risposte agli stimoli rilevanti come ad esempio l'agonista del recettore del glutammato NMDA e confronta se queste ed altre risposte sono influenzati da invecchiamento. Questa procedura può produrre nuove intuizioni su come l'invecchiamento influenza citosolica e mitocondriale risposte Ca 2+ agli stimoli selezionati, nonché la sperimentazione di farmaci selezionati volti a prevenire cella neuronemorte in malattie legate all'età.
Eccitotossicità è uno dei meccanismi più importanti che contribuiscono a danno neuronale e la morte cellulare in insulti neurologici quali ischemia, e in alcune malattie neurodegenerative come il morbo di Alzheimer 1. Questo tipo di neurotossicità è mediato principalmente da glutammato agisce su Ca 2+ -permeable, recettori ionotropici NMDA (NMDAR) 2. L'esposizione di neuroni in coltura per il glutammato può portare a eccitotossicità 3, che provoca l'apoptosi neuronale 4. Noi e altri abbiamo già riferito che la vulnerabilità neuronale all'apoptosi NMDA indotta può cambiare con lo sviluppo in vitro e l'invecchiamento 5-8.
È ampiamente accettato che un aumento del libero citosolico Ca 2+ concentrazione ([Ca 2+] cyt) porta all'attivazione cellule. Tuttavia, se questo aumento è troppo alta e / o di sostegno sufficientemente, può innescare la morte cellulare 9. Inoltre, è stato propostoeccitotossicità che richiede Ca 2+ mitocondriale assorbimento 10, poiché il trattamento con neuroni neuroni protette contro disaccoppiatore mitocondriale indotta da glutammato morte cellulare 11. Se mitocondri occupano troppo Ca 2+, l'apertura del poro di transizione di permeabilità mitocondriale può verificarsi, che porta al rilascio del citocromo c ed altri fattori pro-apoptotica, e inducendo apoptosi. Abbiamo recentemente dimostrato che questo mitocondriale Ca 2+ assorbimento è direttamente correlata alla suscettibilità età-dipendente per eccitotossicità, misurando direttamente NMDA indotta mitocondriale Ca 2+ uptake in singoli neuroni ippocampali 5, un metodo che viene riportato in questo articolo. L'ippocampo, coinvolto in processi fisiologici, come l'apprendimento, la memoria e altri processi cognitivi 12, è altamente vulnerabile a invecchiamento e malattie neurodegenerative 13. E 'stato proposto che, dopo diverse settimane in vitro, coltaneuroni ippocampali mostrano una serie di caratteristiche tipiche di neuroni dai 14. Di conseguenza, colture di neuroni dell'ippocampo a lungo termine possono fornire un modello globale per indagare Ca 2+ meccanismi mediata di una maggiore eccitotossicità nell'invecchiamento.
L'obiettivo generale del metodo presentato è, quindi, di indagare i cambiamenti sostanziali nel intracellulare di Ca 2+ omeostasi o Ca 2+ rimodellamento nel cervello di invecchiamento tra cui il differenziale Ca 2+ risposte indotte da agonisti del recettore NMDA in una prospettiva a lungo termine colture di neuroni dell'ippocampo . Il metodo comprende una descrizione dettagliata della cultura di neuroni ippocampali di ratto e il monitoraggio di citosolici e mitocondriali Ca 2+ concentrazioni da fluorescenza e l'imaging bioluminescenza in singoli neuroni rispettivamente. Imaging di fluorescenza di citosoliche Ca 2+ in neuroni in coltura è una procedura standard. Tuttavia, questo metodo è meno affidabile per subcellulare Ca 2+ misure tra cui mitocondriale Ca 2+. Le ragioni di questa includono la mancanza di una corretta mirati sonde sintetiche e affinità inadeguato per Ca 2 + concentrazioni che possono cambiare nei mitocondri dal livello di micron basso anche per il livello di mm. L'utilizzo di Ca 2+ sonde a base di proteine come ad esempio equorina, ha permesso di organelli subcellulari di targeting e l'utilizzo di derivati diversi Ca 2+ affinità utilizzando diversi coelenterazines o sonde mutanti privi specifico Ca 2+ siti di legame 15. In questo modo, bioluminescenza di cellule che esprimono equorina mitocondri mirati può consentire il monitoraggio dei mitocondriali di Ca 2+ concentrazioni in singoli neuroni. Tuttavia, questa procedura può richiedere l'uso di macchine fotografiche di conteggio di fotoni o telecamere CCD ultrasensibili per bioluminescenza 16-18. Questo metodo può produrre nuovi risultati che dovrebbero essere confermata in più establmodelli mentata invecchiamento del cervello come, ad esempio, fette di cervello da vecchi animali.
La ristrutturazione di Ca 2+ intracellulare omeostasi nel cervello che invecchia è stata collegata alla perdita cognitiva, aumentata suscettibilità alle ischemico danni, eccitotossicità e neurodegenerazione. Per studiare questa ipotesi in vitro, le procedure di imaging Ca 2+ sono disponibili. Purtroppo, colture vitali di vecchi neuroni dell'ippocampo non sono affidabili. Recentemente, è stato osservato che le culture a lungo termine di ratto hippocampal neuroni presenti molte delle…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by Ministerio de Economìa y competitividad (BFU2012-37146) and Junta de Castilla y Leòn (BIO103/VA45/11, VA145U13 and BIO/VA33/13), Spain. MCR was supported by Junta de Castilla y Leòn (Spain) and the European Social Fund. We thank the late Dr. Philippe Brûlet (1947-2013) for the mitochondrial GFP Aequorin plasmid.
Neurobasal Culture Medium | Gibco | 21103-049 | |
HBSS medium | Gibco | 14170-088 | |
Ham's F-12 medium | Gibco | 31330-038 | |
DNase I (from bovine pancreas) | Sigma | D5025-15KU | |
Fetal Bobine Serum | Lonza | DE14-801E | |
B27 | Gibco | 17504-044 | |
Gentamicin | Gibco | 15750 | |
L-glutamine | Gibco | 25030-032 | |
12 mm glass coverslips | Labolan | 0111520/20012 | |
Papain | Worthington | LS003127 | |
4-well multidish plaques | Nunc | 176740 | |
Petry dishes | JD Catalan s.l. | 2120044T | |
Sterile pipettes | Fisher Scientific | 431030 | |
Fura2-AM | Life Technologies | F1201 | |
Lipofectamine2000 | Invitrogen | 11668-027 | |
Coelenterazine n | Biotium | BT-10115-2250 uG | |
Digitonin | Sigma | D5628 | |
NMDA | Sigma | M3262 | |
Glycine | Sigma | 50046 | |
Zeiss Axiovert S100 TV microscope | Carl Zeiss Inc. | ||
Xcite ilumination system | EXFO | ||
ORCA ER fluorescence camera | Hamamatsu | ||
VIM photon counting CCD camera | Hamamatsu | ||
VC-8 valve controller | Warner Instruments | ||
SH-27B heating system | Warner Instruments | ||
Aquacosmos Software | Hamamatsu Photonics |