BM12 Индуцибельная Модель волчанка (СКВ) в C57BL / 6 мышей
Summary
The transfer of bm12 lymphocytes into a C57BL/6 recipient is an established model of systemic lupus erythematosus. Here we describe how to initiate disease using this model and how to characterize T follicular helper cells, germinal center B cells and plasma cells by flow cytometry.
Abstract
Systemic lupus erythematosus (SLE) is an autoimmune disease with diverse clinical and immunological manifestations. Several spontaneous and inducible animal models mirror common components of human disease, including the bm12 transfer model. Upon transfer of bm12 splenocytes or purified CD4 T cells, C57BL/6 mice rapidly develop large frequencies of T follicular helper cells (Tfh), germinal center (GC) B cells, and plasma cells followed by high levels of circulating anti-nuclear antibodies. Since this model utilizes mice on a pure C57BL/6 background, researchers can quickly and easily study disease progression in transgenic or knockout mouse strains in a relatively short period of time. Here we describe protocols for the induction of the model and the quantitation Tfh, GC B cells, and plasma cells by multi-color flow cytometry. Importantly, these protocols can also be used to characterize disease in most mouse models of SLE and identify Tfh, GC B cells, and plasma cells in other disease models.
Introduction
Системная красная волчанка (СКВ) является сложным аутоиммунным заболеванием характеризуется прототипически анти-ядерных антител (ANA) производства и гломерулонефрит. Многочисленные другие последствия, в том числе кожных, сердечно-легочная и печеночные поражения, связанные с болезнью в некоторых лиц. Оценки распространенности в США широко варьироваться, от 150,000-1,500,000 1,2, с особенно высокой заболеваемости у женщин и меньшинств 3. Хотя этиология СКВ было трудно различить, что, как полагают, является результатом взаимодействия различных генетических и экологических факторов, которые достигают высшей точки в системной аутоиммунной реакции.
Многочисленные модели на животных были использованы для изучения факторов, ведущих к начала заболевания и прогрессии. Классические модели мыши СКВ включают генетически предрасположенных линий мышей в том числе NZB х модели NZW F1 и его производных, в NZM / LPR деформации MLR, и штамма BXSB / Yaa и индуцируемых систем, таких, как рristane и хронический трансплантат-против-хозяина (cGVHD) модели 4. Ранние сообщения о аутоантител в моделях РТПХ использовали различные штаммы мыши или хомяка штаммов для родителей в F1 переводов 5 – 8; более общие методы, используемые для изучения красная, как болезнь в настоящее время включают в себя DBA / 2 родителя → (C57BL / 6 х DBA / 2) F1, и модель передачи BM12, описанной здесь. Каждая модель имеет свои собственные предостережения, но они, как правило имеют общий набор функций, которые коррелируют с клиническими особенностями заболевания человека. Наиболее часто сообщают параметры в мышиных моделях включает спленомегалия, лимфаденопатии, нефрит, ANA производства и на клеточном уровне, расширение Т-клеток-хелперов фолликулярных (TFH), зародышевых центров (GC) В-клеток и клеток плазмы.
Индуцируемый модель BM12 достигается приемных передачи лимфоцитов от ИА BM12 B6 (C) – Н2 – Ab1 BM12 / BM12 KhEgJ () мышей, штамм яdentical в C57BL / 6 на 3 аминокислотных замен на МНС класса II, за исключением, в IA б C57BL / 6 (В6) мышей. Alloactivation донорских лимфоцитов CD4 получателем БТР приводит к cGVHD с симптомами, напоминающие СКВ тесно. В частности, к ним относятся расширение донорской полученных ЦГВЗ, расширение получателей полученных GC-клеток и клеток плазмы, и производство НАНА включая анти-двухцепочечной ДНК, анти-одноцепочечной ДНК, анти-хроматина, и анти-RBC антител 9. Со временем, мыши-реципиенты развивать гломерулонефрит, связанный с IgG депозитов в клубочковой, интерстициальный и сосудистых регионах почек 10. Недавно мы показали, что подобно болезни человека, существует также критически роль IFN типа I в этой модели 11. Примечательно, что определяющие критерии для человека СКВ включают разработку нефрит, совместимый с СКВ в присутствии уровнем антител против дцДНК 12, оба из которых являются характерные особенности этой модели мыши.
Есть себеVeral преимущества BM12 модели за спонтанных моделей. Классические модели, которые развиваются СКВ, как признаки спонтанно либо полагаться на гибридных штаммов мыши, инбредных линий мышей не на B6 фоне, или большой генетических локусов на фоне B6, которые делают, пересекающих нокаут или иначе генетически модифицированных мышей сложным и трудоемким. С BM12 индуцибельного модели, генетически модифицированные мыши могут служить либо донора или получателя, что позволяет более быструю идентификацию сотового отсека, в котором конкретные гены могут иметь важное значение для болезни. Кроме того, развитие болезни в модели BM12 гораздо быстрее, не требуя всего 2 недели до появления НАНА, по сравнению с несколько месяцев для наиболее спонтанных моделей. Кроме того, в отличие от спонтанных моделей, которые развиваются болезни на разных временных точках, начало заболевания и прогрессирования в BM12 → B6 модели высоко синхронизированы. Это позволяет для генерации соответствующего размера когорт, которые могут бе используется для интервенционных или терапевтических стратегий на любой стадии развития заболевания.
Далее следует подробное протокол инициирования SLE, как аутоиммунные заболевания с приемной передачи BM12 лимфоцитов в C57BL / 6 мышей, или генетических вариантов на B6 фоне. Кроме того, мы опишем протокол окрашивания проточной цитометрии для перечисления TFH, GC-клетки, а также типы плазматические клетки-клеток, связанная с заболеванием человека. Важно отметить, что эти протоколы могут быть также использованы для описания болезни в большинстве мышиных моделях СКВ и определить TFH, GC-клетки и плазматические клетки в других моделях болезни.
Protocol
Representative Results
Discussion
BM12 индуцируемый модель является относительно простой и эффективный способ для изучения клеточных и молекулярных процессов СКВ. Хронический активации адаптивно переданных лимфоцитов CD4, направленных против аутоантигенов приводит к накоплению TFH, GC-клеток, и клетки плазмы, которые мог?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported in part by the Lupus Research Institute, NCI grant CA138617, NIDDK grant DK090978, Charlotte Schmidlapp Award (to E.M.J.), and the Albert J. Ryan Fellowship (to J.K.). We are grateful for the support and instrumentation provided by the Research Flow Cytometry Core in the Division of Rheumatology at Cincinnati Children’s Hospital Medical Center, supported in part by NIH AR-47363, NIH DK78392 and NIH DK90971.
Materials
| B6.SJL-Ptprca Pepcb/BoyJ | The Jackson Laboratory | 001162 | CD45.1+ BoyJ mouse strain |
| B6(C)-H2-Ab1bm12/KhEgJ | The Jackson Laboratory | 001162 | Bm12 mouse strain |
| FastDigest PsuI | Life Technologies | FD1554 | Restriction digest enzyme for genotyping |
| 1X RBC Lysis Buffer | eBioscience | 00-4333-57 | |
| IMDM | GE Healthcare | SH30228.01 | |
| Plasma Separation Tube (PST) | BD | 365974 | Blood collection tube with Dipotassium EDTA |
| Serum Separation Tube (SST) | BD | 365967 | Blood collection tube with Clot activator / SST Gel |
| Ficoll | GE Healthcare | 17-1440-02 | High density cell separation solution |
| Lympholyte-M | Cedarlane | CL5030 | High density cell separation solution |
| GL-7-biotin | eBioscience | 13-5902-82 | |
| Streptavidin-BUV395 | BD | 564176 | |
| CD138-BV421 | BioLegend | 142508 | |
| CD4-BV510 | BioLegend | 100559 | |
| TCRβ-BV605 | BD | 562840 | |
| CD45.1-BV711 | BioLegend | 110739 | |
| CD45.2-FITC | BioLegend | 109806 | |
| PD-1-PE | BioLegend | 135206 | |
| CD19-PerCP | BioLegend | 115532 | |
| Fas-PE-Cy7 | BD | 557653 | |
| CXCR5-APC | BioLegend | 145506 | |
| Fixable Viability Dye ef780 | eBioscience | 65-0865-18 | |
| CD4-BV421 | BioLegend | 100443 | |
| 1.2 ml FACS tube inserts, racked | USA Scientific | 1412-1400 | |
| BD Falcon™ Round-Bottom Tubes | BD | 352017 |
References
- Helmick, C. G., Felson, D. T., et al. Part I. Arthritis Rheum. Estimates of the prevalence of arthritis and other rheumatic conditions in the United States. 58, 15-25 (2008).
- Somers, E. C., Marder, W., et al. Population-based incidence and prevalence of systemic lupus erythematosus: The Michigan lupus epidemiology and surveillance program. Arthritis and Rheumatol. 66, 369-378 (2014).
- Perry, D., Sang, A., Yin, Y., Zheng, Y. -. Y., Morel, L. Murine models of systemic lupus erythematosus. J Biomed Biotechnol. 2011, 271694 (2011).
- Lindholm, L., Rydberg, L., Strannegård, O. Development of host plasma cells during graft-versus-host reactions in mice. Eur J Immunol. 3 (8), 511-515 (1973).
- Fialkow, P. J., Gilchrist, C., Allison, A. C. Autoimmunity in chronic graft-versus-host disease. Clin Exp Immunol. 13, 479-486 (1973).
- Streilein, J. W., Stone, M. J., Duncan, W. R. Studies on the Specificity of Autoantibodies Produced in Systemic Graft-vs-Host Disease. J Immunol. 114 (1), 255-260 (1975).
- Gleichmann, E., Gleichmann, H. Diseases caused by reactions of T lymphocytes to in compatible structures of the major histocompatibility complex. I. Autoimmune hemolytic anemia. Eur J Immunol. 6 (12), 899 (1976).
- Morris, S., Cohen, P. L., Eisenberg, R. Experimental induction of systemic lupus erythematosus by recognition of foreign Ia. Clin Immunol Immunopathol. 57 (2), 263-273 (1990).
- Chen, F., Maldonado, M., Madaio, M., Eisenberg, R. The Role of Host (Endogenous) T Cells in Chronic Graft-Versus-Host Autoimmune Disease. J Immunol. 161 (11), 5880-5885 (1998).
- Klarquist, J., Hennies, C. M., Lehn, M. A., Reboulet, R. A., Feau, S., Janssen, E. M. STING-Mediated DNA Sensing Promotes Antitumor and Autoimmune Responses to Dying Cells. J Immunol. 193, 6124-6134 (2014).
- Petri, M., Orbai, A. -. M., et al. Derivation and validation of systemic lupus international collaborating clinics classification criteria for systemic lupus erythematosus. Arthritis Rheum. 64 (8), 2677-2686 (2012).
- Zangala, T. Isolation of genomic DNA from mouse tails. J Vis Exp. (6), e246 (2007).
- Lorenz, T. C. Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies. J Vis Exp. (63), e3998 (2012).
- . Product information: Thermo Scientific FastDigest PsuI Available from: https://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/MAN0012567_FastDigest_PsuI_UG.pdf (2012)
- Matheu, M. P., Parker, I., Cahalan, M. D. Dissection and 2-photon imaging of peripheral lymph nodes in mice. J Vis Exp. (7), e265 (2007).
- Harrell, M. I., Iritani, B. M., Ruddell, A. Lymph node mapping in the mouse. J Immunol Methods. 332 (1-2), 170-174 (2008).
- Covelli, V. Chapter 3, Internal examination. Guide to the necroscopy of the mouse. , (2009).
- Quah, B. J. C., Parish, C. R. The use of carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) to monitor lymphocyte proliferation. J Vis Exp. (44), e2259 (2010).
- Matheu, M. P., Cahalan, M. D. Isolation of CD4+ T cells from mouse lymph nodes using Miltenyi MACS purification. J Vis Exp. (9), e53319 (2007).
- Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual Restraint and Common Compound Administration Routes in Mice and Rats. J Vis Exp. (67), e2771 (2012).
- Hoff, J. Methods of Blood Collection in the Mouse. Lab Animal. 29 (10), 47-53 (2000).
- Cohen, M., Varki, N. M., Jankowski, M. D., Gagneux, P. Using Unfixed, Frozen Tissues to Study Natural Mucin Distribution. J Vis Exp. (67), e3928 (2012).
- Cohen, P. L., Maldonado, M. A. Animal models for SLE. Curr Protoc Immunol.. Chapter 15, Unit 15.20 (2003).
- Seavey, M. M., Lu, L. D., Stump, K. L. Animal models of systemic lupus erythematosus (SLE) and ex vivo assay design for drug discovery. Curr Protoc Pharmacol. Chapter 5, Unit 5 (2011).
- McKenna, K. C., Vicetti Miguel, R. D., Beatty, K. M., Bilonick, R. A. A caveat for T cell transfer studies: generation of cytotoxic anti-Thy1.2 antibodies in Thy1.1 congenic mice given Thy1.2+ tumors or T cells. J Leukoc Biol. 89 (2), 291-300 (2011).
- Scott, D. M., Ehrmann, I. E., et al. Identification of a mouse male-specific transplantation antigen H-Y.. Nature. 376, 695-698 (1995).
- Joly, E., Hudrisier, D. What is trogocytosis and what is its purpose. Nat Immunol. 4 (9), 815 (2003).
- Brown, D. R., Calpe, S., et al. Cutting edge: an NK cell-independent role for Slamf4 in controlling humoral autoimmunity. J Immunol. 187 (1), 21-25 (2011).
- Morris, S. C., Cheek, R. L., Cohen, P. L., Eisenberg, R. A. Allotype-specific immunoregulation of autoantibody production by host B cells in chronic graft-versus host disease. J Immunol. 144 (3), 916-922 (1990).
- Choudhury, A., Cohen, P. L., Eisenberg, R. A. B cells require “nurturing” by CD4 T cells during development in order to respond in chronic graft-versus-host model of systemic lupus erythematosus. Clin Immunol. 136 (1), 105-115 (2010).
- Slifka, M. K., Antia, R., Whitmire, J. K., Ahmed, R. Humoral immunity due to long-lived plasma cells. Immunity. 8 (3), 363-372 (1998).
