Summary

Imaging neutrófilos y monocitos en mesentérica venas por Microscopia intravital en ratones anestesiados en Tiempo Real

Published: November 16, 2015
doi:

Summary

We detail a protocol to monitor the behavior of neutrophils and monocytes in mesenteric veins under steady state and inflammatory conditions using intravital confocal microscopy on anaesthetized mice.

Abstract

Respuesta inmune eficiente depende de la rápida movilización de leucocitos de la sangre al sitio de la infección o lesión. La investigación de la migración de leucocitos in vivo es crucial para entender la base molecular de la migración transendotelial de leucocitos y la interacción con el endotelio vascular. Un enfoque poderoso implica microscopía intravital en ratones transgénicos que expresan las proteínas fluorescentes en las células de interés.

Aquí se presenta un protocolo para los monocitos de imágenes y neutrófilos en el CX 3 CR1 gfp / peso iv ratón inyectado con neutrófilos marcado tinte de color naranja con un microscopio confocal invertido. Películas Time-lapse recogidos de 30 minutos a varias horas de imágenes de permitir el análisis del comportamiento de leucocitos en las venas mesentéricas, tanto en condiciones de estado estacionario e inflamatorias. También describe los pasos para inducir localmente inflamación de los vasos de sangre con TLR2 / TLR1 agonista Pam3SK4 y supervisar el subsequent reclutamiento de neutrófilos y monocitos.

La técnica presentada también se puede utilizar para controlar otras poblaciones de leucocitos e investigar moléculas implicadas en el reclutamiento de leucocitos o el tráfico que utilizan otros estímulos o ratones transgénicos.

Introduction

Los neutrófilos y los monocitos son las células del sistema inmune innato que circulan continuamente en la sangre. Tras la lesión o infección, inducen señales inflamatorias diapedesis de leucocitos en los tejidos dañados y infectadas, en el presente documento iniciar una respuesta inmune celular a 1-3. La rapidez de la movilización de leucocitos determina el resultado positivo de las respuestas inmunes. Estos procesos complejos se basan en moléculas específicas (por ejemplo, selectinas, quimiocinas endotelio unida) presentes en el endotelio inflamado que ayudan para el establecimiento de contactos adhesivas entre leucocitos circulantes y el endotelio 1-3 .Para obtener ideas sobre las moléculas implicadas en los leucocitos cascada de reclutamiento, es importante para visualizar la cinética de reclutamiento de células y para rastrear el comportamiento de cada célula / población. Un método eficaz consiste en microscopía intravital en ratones transgénicos que expresan las proteínas fluorescentes en las células de interés.

contenido "> Hasta la fecha, varios enfoques mediante microscopía intravital se desarrollaron para la imagen de la vasculatura 4,5. Por ejemplo, se utilizó la imagen de la dermis del oído vasculatura o venas mesentéricas por microscopía confocal intravital para identificar el comportamiento de patrullaje de Ly6C murino monocitos bajos y humana CD14 dim monocitos CD16 + en el lado luminal de los vasos sanguíneos en condiciones de estado estacionario 6-8. El modelo vasculatura cremáster ratón se utiliza a menudo para monitorear el comportamiento de neutrófilos o monocitos Ly6c inflamatoria altos en condiciones inflamatorias o isquémicas en ratones transgénicos. En ese caso, cremáster se estimula a través de la inyección de intraescrotal IL1β, CCL2, TNFß o fMLP. Después de 2-4 horas, tejidos se exteriorizan y se analizaron por microscopía confocal intravital 9-11 quirúrgicamente.

El siguiente protocolo describe un método para monitorear monocitos y neutrófilos, al mismo tiempo con cualquierde fluorescencia invertida microscopio confocal. Por otra parte, nuestro método detalla cómo reproducir el mismo recipiente antes (condición de estado estable) y después de la inflamación y cómo seguir la cinética de reclutamiento de leucocitos. Para este fin, se utiliza el CX 3 CR1 ratón gfp / peso, cuya monocitos expresar eGFP, iv inyectado con una naranja neutrófilos murinos marcados con colorante. El uso de un microscopio confocal invertido, es posible (1) para rastrear y analizar los monocitos bajos Ly6c patrullaje bajo condiciones de estado estacionario y (2) para seguir el reclutamiento de monocitos y neutrófilos ambos en el mismo recipiente después de la inflamación local. Aquí creamos las condiciones inflamatorias mediante el agonista TLR2 / TLR1 Pam3CSK4 12. Además, tal formación de imágenes puede ayudar a determinar el papel de las moléculas específicas de interés en las diversas etapas de la cascada de reclutamiento de leucocitos si se realiza en ratones knock-out específicas o en presencia de anticuerpos bloqueantes 6,9,13.

Protocol

NOTA: Los procedimientos en animales se realizaron de acuerdo con el Comité de Ética Institucional de Cuidado de Animales en Ginebra, Suiza y la Oficina Veterinaria Cantonal. Número de Autorización de GE / 63/14. 1. Preparación de una suspensión de células individuales a partir de médula ósea Sacrificio del ratón (8-12 semanas de edad) por dislocación cervical. Esterilizar patas traseras con etanol al 70%. Retire la piel de las patas traseras. Diseccionar fém…

Representative Results

El manuscrito describe un protocolo optimizado para controlar fácilmente el comportamiento de los monocitos y neutrófilos en las venas mesentéricas de ratones anestesiados en tiempo real. El uso de una cámara termostatizada-C 37 ° es obligatoria para mantener la temperatura del ratón y también debido al movimiento dependiente de la temperatura de los leucocitos. Preparación del ratón se muestra en la Figura 1. La Figura 2 muestra toda la zona visto bajo el microscopio. Luz tran…

Discussion

Las metodologías descritas en este manuscrito proporcionan un enfoque coherente para estudiar de manera eficiente los monocitos y el comportamiento de los neutrófilos en las venas mesentéricas bajo condiciones de estado estacionario e inflamatorias.

El paso crucial de la preparación es la inmovilización del intestino con tejidos contacto con el medio PBS. Si se realiza correctamente, los vasos mesentéricos están muy bien expuestos en el cubreobjetos para la adquisición de imágenes. …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by EMBO (to Y.E.), Foundation Machaon (to Y.E.) and SNSF (to B.A.I.). We thank the Bioimaging Core Facility for the availability of the Nikon A1r microscope and technical assistance. We thank Mrs. Clarissa Bartley for English correction.

Materials

5 mL polystyrene round bottom tubes  Beckton Dickinson 352058
10x CFI Plan Apochromat 0.45   DT:4mm  Nikon
20x CFI Plan Apochromat VC 0.75   DT:1mm  Nikon
Cell Tracker Orange CMRA Dye Life Technologies C34551
EasySep Magnet Stem Cell Technologies 18000
EasySep Mouse Neutrophil Enrichement kit Stem Cell Technologies 19762
EDTA Sigma Aldrich E6758
FCS PAA A15-042
Immersion Oil Type A Nikon any viscous oil 
Life Box Temperature Control System Life Imaging
NaHCO3 Sigma Aldrich S5761
NH4Cl Sigma Aldrich A9434
Nikon A1R confocal microscope Nikon A1R inverted microscope, motorized x/y/z stage, NIS elements software
PBS Life Technologies D8537
phenol red free DMEM/F12 Life Technologies 21041-025 any phenol red free medium is suitable
PAM3CSK4 Invivogen tlrl-pms reconstitute in PBS
Rat serum Stem Cell Technologies included in EasySep Mouse Neutrophil Enrichement kit
tissue culture dish 100 TPP 93100

References

  1. Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat Rev Immunol. 7, 678-689 (2007).
  2. Nourshargh, S., Hordijk, P. L., Sixt, M. Breaching multiple barriers: leukocyte motility through venular walls and the interstitium. Nat Rev Mol Cell Biol. 11, 366-378 (2010).
  3. Nourshargh, S., Alon, R. Leukocyte migration into inflamed tissues. Immunity. 41, 694-707 (2014).
  4. Ley, K., et al. Chapter 11. Intravital microscopic investigation of leukocyte interactions with the blood vessel wall. Methods Enzymol. 445, 255-279 (2008).
  5. Sperandio, M., Pickard, J., Unnikrishnan, S., Acton, S. T., Ley, K. Analysis of leukocyte rolling in vivo and in vitro. Methods Enzymol. 416, 346-371 (2006).
  6. Auffray, C., et al. Monitoring of blood vessels and tissues by a population of monocytes with patrolling behavior. Science. 317, 666-670 (2007).
  7. Cros, J., et al. Human CD14dim monocytes patrol and sense nucleic acids and viruses via TLR7 and TLR8 receptors. Immunity. 33, 375-386 (2010).
  8. Hanna, R. N., et al. The transcription factor NR4A1 (Nur77) controls bone marrow differentiation and the survival of Ly6C- monocytes. Nat Immunol. 12, 778-785 (2011).
  9. Woodfin, A., et al. The junctional adhesion molecule JAM-C regulates polarized transendothelial migration of neutrophils in vivo. Nat Immunol. 12, 761-769 (2011).
  10. Proebstl, D., et al. Pericytes support neutrophil subendothelial cell crawling and breaching of venular walls in vivo. J Exp Med. 209, 1219-1234 (2012).
  11. Wantha, S., et al. Neutrophil-derived cathelicidin promotes adhesion of classical monocytes. Circ Res. 112, 792-801 (2013).
  12. Ozinsky, A., et al. The repertoire for pattern recognition of pathogens by the innate immune system is defined by cooperation between toll-like receptors. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 97, 13766-13771 (2000).
  13. Lammermann, T., et al. Neutrophil swarms require LTB4 and integrins at sites of cell death in vivo. Nature. 498, 371-375 (2013).
  14. Carlin, L. M., et al. Nr4a1-dependent Ly6C(low) monocytes monitor endothelial cells and orchestrate their disposal. Cell. 153, 362-375 (2013).
  15. Hamon, P., Rodero, M. P., Combadiere, C., Boissonnas, A. Tracking mouse bone marrow monocytes in vivo. J Vis Exp. , (2015).
  16. Iqbal, A. J., et al. Human CD68 promoter GFP transgenic mice allow analysis of monocyte to macrophage differentiation in vivo. Blood. 124, e33-e44 (2014).
  17. Jenne, C. N., Wong, C. H., Petri, B., Kubes, P. The use of spinning-disk confocal microscopy for the intravital analysis of platelet dynamics in response to systemic and local inflammation. PloS One. 6, e25109 (2011).

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Cite This Article
Emre, Y., Jemelin, S., Imhof, B. A. Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time. J. Vis. Exp. (105), e53314, doi:10.3791/53314 (2015).

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