We present an automated modular high-throughput-method for the identification and characterization of microbial exopolysaccharides in small scale. This method combines a fast preselection to analyze the total amount of secreted polysaccharides with a detailed carbohydrate fingerprint to enable the fast screening of newly isolated bacterial strains or entire strain collections.
Muchos microorganismos son capaces de producir y secretar exopolisacáridos (EPS), que tienen importantes implicaciones en los campos médicos, aplicaciones de alimentos o en la sustitución de productos químicos basados en petroquímicos. Se describe una plataforma de análisis para ser automatizado en un sistema de tratamiento de líquidos que permite el análisis rápido y fiable del tipo y la cantidad de EPS producidas por microorganismos. Se permite al usuario identificar nuevos productores de exopolisacáridos microbianas naturales y analizar la huella digital de hidratos de carbono de los polímeros correspondientes dentro de un día en de alto rendimiento (HT). El uso de esta plataforma, colecciones de cepas, así como bibliotecas de variantes de cepas que podrían ser obtenidos en los enfoques de ingeniería pueden ser examinados. La plataforma tiene una configuración modular, lo que permite una separación del protocolo en dos partes principales. En primer lugar, hay un sistema de detección automatizada, que combina diferentes módulos de detección de polisacárido: un análisis semi-cuantitativo de viscosity la formación a través de una etapa de centrifugación, un análisis de la formación de polímero a través de precipitación con alcohol y la determinación del contenido total de hidratos de carbono a través de una transformación de fenol-ácido sulfúrico. Aquí, es posible seleccionar hasta 384 cepas por corrida. La segunda parte ofrece un análisis monosacárido detallada para todos los productores de EPS seleccionados identificados en la primera parte mediante la combinación de dos módulos esenciales: el análisis de la composición de monómero completa mediante cromatografía líquida de ultra-alto rendimiento junto con la luz ultravioleta y la ionización por electrospray detección de trampa de iones ( UHPLC-UV-ESI-MS) y la determinación de piruvato como sustituyente polímero (presencia de cetal piruvato) a través de la oxidación enzimática que se acopla a una formación de color. Todos los módulos de análisis de esta plataforma de cribado se pueden combinar de diferentes maneras y se ajustan a las necesidades individuales. Además, todos ellos pueden ser manejados manualmente o realizarse con un sistema de manejo de líquidos. De esta manera, el pla de cribadoTForm permite una gran flexibilidad con el fin de identificar las diversas EPS.
exopolisacáridos microbianos (EPS) son un grupo estructuralmente muy diversa de polímeros que cumplen diversas funciones biológicas. Por lo general se construyen de unidades repetitivas complejas, que se distinguen por diferentes tipos de monómeros (azúcar, derivados de azúcares, ácidos azúcar), los enlaces entre estos monómeros y sus sustituciones. La diversidad estructural de los polisacáridos microbianos confiere características muy diferentes a los miembros de esta clase molécula, lo que permite su aplicación en diferentes campos como la alimentación 1, 2,3 cosméticos, química construcción de 4 o 5 de tratamiento de agua. Para ampliar aún más el campo de aplicación de estos polímeros sostenibles de base biológica y tales la identificación de nuevos polisacáridos microbianos naturales, así como la ingeniería de variantes estructurales representa enfoques prometedores. De cualquier manera, se requiere un método de cribado rápido para explorar rápidamente un gran número de cepas microbianas para their formación de polisacárido, y analizar sus productos. Por lo tanto, hemos desarrollado recientemente una plataforma HT-cribado de 96 pocillos para el análisis de la producción de polisacáridos microbianos a partir de aislados naturales o variantes de cepas de ingeniería que incluye la identificación de la composición monomérica 6.
La aplicación de esta plataforma para una primera ronda de cribado de ~ 500 aislados naturales nos permitió identificar sólo alrededor del 10 al 20% de las cepas aisladas como ser capaz de producir EPS (datos no mostrados). Esto significa que el 80-90% de las cepas analizadas no produjo EPS en las condiciones aplicadas, y por lo tanto, un nuevo análisis de la huella digital detallada de hidratos de carbono no era necesario. Como esta identificación altamente sofisticado de la composición monomérica es un proceso que consume tiempo, especialmente para el análisis de datos, un método de pre-selección rápido para identificar las cepas positivas en la producción de EPS, aumentaría drásticamente la eficiencia. Además, los reactivos,consumibles y tiempo de medición en el UHPLC-UV-ESI-MS se reducirían. Además, los diferentes módulos de análisis, mientras que por un lado hacer que el método altamente fiable, son por el contrario lo que complica la manipulación manual de más de dos placas de 96 pocillos en paralelo, y como tal restringir al máximo el potencial del método. Por estas razones, hemos decidido desarrollar una plataforma de exploración automático. Por lo tanto, se combinaron el formato modular de la técnica de la huella digital de hidratos de carbono existente con un método de detección rápido totalmente automatizada del contenido total de azúcar, basado en la medición de la absorbancia.
El método de fenol-ácido sulfúrico representa todavía el método de elección para la determinación rápida del contenido total de hidratos de carbono de polisacáridos bacterianos de plantas y 7,8. Este método fue descrito por primera vez por Dubois et al. 9 y adaptado para diferentes aplicaciones y tamaños de muestra, incluso para pequeña escala en placas de 96 pocillos 10,11. el phemétodo nol-ácido sulfúrico-mide el contenido total de carbohidratos por un valor, summating todo monómeros, oligómeros y los carbohidratos poliméricos de las muestras.
Teniendo en cuenta estos aspectos, la elección de un medio de cultivo adecuado es esencial para aplicar este método. medios complejos que contienen oligómeros o compuestos poliméricos de hidratos de carbono como el extracto de levadura pueden conducir a un contenido de polímero modificado y, por tanto, en sentido estricto debe ser evitado. Además, altas cantidades de azúcares se utilizan como fuente de C para el cultivo de las cepas. Los altos niveles de hidratos de carbono restantes del proceso de cultivo podrían interferir negativamente con la medición del contenido de EPS.
Por lo tanto, se aconseja el uso de azúcares definidos y puros. En nuestros experimentos usamos la glucosa para el cultivo de las células. La glucosa restante después del cultivo se redujo a través de una filtración en gel y se determina a través de una glucosa-ensayo. Por último, el equivalente de glucosas de los polisacáridos se calcularon restando la glucosa restante después de la filtración en gel a partir del contenido total de carbohidratos que había sido detectado con el método de fenol-ácido sulfúrico. Filtración en gel y la glucosa-ensayo en combinación con el método de fenol-ácido sulfúrico-garantizan resultados fiables y son capaces de ser nuestra primera, sistema de detección completamente automatizada.
Dos nuevos módulos de análisis se incluyeron en la plataforma de cribado automatizado para aumentar la cantidad de información desde el sistema de detección de EPS: la precipitación y la observación de un aumento de la viscosidad.
Muchos EPS diferentes – por ejemplo, succinoglicano, xantano y colon ácido 12 – se informa que ser modificado con un cetal piruvato no de hidratos de carbono en las posiciones de azúcar C4 y C6. Esos cetales piruvato (justo como ésteres succinil medio y ácidos urónicos) contribuyen a la naturaleza polianiónica y, por tanto, a la prope físicarties del polímero mediante la interacción a través de puentes de cationes divalentes 13. Con el fin de identificar aquellos polímeros particular la determinación de piruvato se estableció como otro módulo de análisis adicional. Esto aumenta la información acerca de los sustituyentes de polisacáridos y sus propiedades macroscópicas potenciales.
La combinación de todos los módulos permite la identificación de diferentes EPS, así como una determinación rápida y eficiente de los productores de EPS. Por que el enfoque de la plataforma de cribado podría dividirse en dos partes principales (Figura 1). Dentro de la proyección automatizada (parte I) se produce el flujo de trabajo totalmente automatizado (Tabla 1) para preseleccionar rápidamente las cepas productoras de EPS. El análisis de carbohidratos de huellas digitales (parte II) determina cuantitativamente la composición de monómero de la EPS producidos por las cepas preseleccionadas. De este modo, el análisis de datos se reduce al mínimo con el fin de optimizar la detección de grandes colecciones de cepas. Estaofrece la posibilidad de analizar 384 cepas en una sola corrida de detección automatizada y con dos carreras que son posibles por día de 768 cepas por día. Además, el análisis de carbohidratos huella digital ofrece una visión general más detallada de todas las EPS identificados. Esto permite el análisis dirigido y la identificación de sólo ligeramente diferentes variantes EPS o otros completamente nuevos en comparación con las estructuras químicas ya descritos de EPS.
Detección de polisacárido con el método de fenol-ácido sulfúrico-: Diferentes monosacáridos muestran diferentes máximos de absorción y coeficientes de extinción molar por el uso de este método 9. Esto da lugar a diferentes máximos de absorción de los polímeros, que contienen varios azúcares en cantidades diferentes. Las diferentes longitudes de onda de absorción máxima para 16 polímeros disponibles en el mercado diferentes se dan en la Tabla 5. Los polímeros se disolvieron (1 g / L) en ddH 2 O, se agitó (150 rpm) durante la noche y se mide con el fenol-ácido sulfúrico-método . goma Diutan mostró los máximos de absorción más baja a 470 nm y ácido hialurónico escleroglucano y la más alta en 484 nm. Basándose en estos resultados 480 nm fue elegido para esta plataforma de cribado. La absorbancia relativa de los polímeros se calculó basándose en la absorbancia obtenida con 1 g / l de glucosa (establecido como 100%). Los resultados más bajos se obtuvieron con escleroglucano y succinoglicano, ambos con 92%. Este fue expreflejada porque escleroglucano solamente contiene glucosa y succinoglicano contiene glucosa y galactosa en una proporción de 7: 1. Ambos polímeros comerciales tienen diferentes pérdidas de secado y diferentes contenidos de cenizas, esta es la razón por la cual no se alcanzó el valor teórico de ~ 110%. Xylan mostró la absorbancia relativa más alta con 311%. La razón de esto es el alto coeficiente de extinción molar logrado a partir de xilosa debido a la forma de furanosa más dominante. A un nivel de 0,1 g / L de glucosa se alcanza el límite de cuantificación, así como el límite de detección a una concentración <0,05 g / L. Sin embargo, el límite de detección para las cepas positivas en la proyección es mayor que 0,7 g / L y por lo tanto, el ensayo mostró un buen rendimiento. Con el fin de conseguir resultados fiables, la glucosa restante después de filtración en gel se determinó con un ensayo de glucosa-y este valor se resta del valor a partir del método de fenol-ácido sulfúrico.
dilución de la glucosa-Ensayo automatizado: El desempeñode la determinación de glucosa después del cultivo (dilución 1: 100) se investigó. Para esto, 10 l de sobrenadante fueron transferidos a 990 l de ddH 2 O en una placa de pozo profundo y se mezclan a través de diez veces aspiración y dispensación 180 l de esta dilución. El segundo paso crítico fue el pipeteado correcto de solamente 5 alícuota l de la dilución 1:10 de la glucosa-ensayo después de filtración en gel. Con el fin de generar el l de dilución 25 de ddH 2 O fueron transferidos con una l-punta 50 primero, después 20 l de ddH 2 O y 5 l de gel filtrado fueron aspirados juntos. Esto asegura una mejor eliminación de la alícuota de 5 l de la punta. Ambos pasos de dilución fueron verificadas con varios estándares de glucosa a través de una glucosa-ensayo. Los resultados para dos concentraciones ejemplares se dan en la Tabla 6 El 1:. Dilución 100 para la determinación del contenido de glucosa después del cultivo mostró una alta precisión para los estándares con un CV & #60; 1,2%. Al mismo tiempo, la precisión de la norma más alta fue de hasta 11,6 (error%). Sin embargo, esto es insignificante como la determinación de la glucosa representa sólo el contenido de glucosa restante después del cultivo y, por tanto, no es importante para la detección del polímero. La dilución 1:10 de la glucosa que queda después de filtración en gel mostró resultados muy fiables con un CV <1,4% y una precisión <2,1% de error.
La consideración de la evaporación: El cribado requiere 3,5 hr de la primera etapa a la primera glucosa-ensayo. Con el fin de averiguar, si este marco de tiempo tiene una influencia en el almacenamiento MTP sin tapar, 50 l de estándares de calibración de glucosa-ensayo fueron almacenados con y sin tapa durante 3,5 horas en el carrusel de robot. En el rango de calibración (45 a 4,5 mg / L) la concentración de la muestra apenas aumentó. Un aumento – causado por la evaporación – estaba por debajo de 2,1% y sólo para las dos concentraciones más bajas (1,8 y 0,9 mg / L) que alcanza hasta el 12,4% ( <strong> Tabla 7).
Filtración en gel: Las altas cantidades de glucosa no metabolizada perturban la detección cuantitativa de la glucosa a partir del polímero hidrolizado. Por lo tanto, se requiere una etapa de filtración en gel para eliminar la glucosa restante después del cultivo. Además, el gel-filtración purifica el polímero que contiene sobrenadante de sales y compuestos de hidratos de carbono monoméricos, otros que la glucosa, para minimizar el fondo analítico en el análisis de monómero. En la etapa de filtración en gel se colocaron 35 l de filtrado en el centro del pozo. Para la validación de la robustez de filtración en gel en el sistema automatizado, se filtraron ocho patrones de calibración de 0,045 hasta 9 g / L de glucosa (n = 8). La glucosa de cada concentración siempre se redujo en más de un 95% del valor inicial (Tabla 8). De este modo, la filtración en gel mostró muy buenos resultados para varias concentraciones de glucosa. Además, la glucosa restante después de gel-filtration También se determinó con un ensayo de glucosa y se resta de la determinación de fenol-ácido sulfúrico para recibir la cantidad correcta de glucosa equivalente para el polímero hidrolizado.
El piruvato-ensayo: En primer lugar, se investigó si la (1:10) TFA-matriz neutralizado y diluido a partir de la etapa de hidrólisis interfiere con la reacción enzimática. Por lo tanto, el ensayo completo se realizó dos veces, una vez con y otra vez sin matriz y mostró resultados fiables. Finalmente, el contenido de piruvato de 16 polímeros disponibles comercialmente se midió con éxito y se representa en la Figura 3. Se sabe en general que, de esos 16 polímeros solamente succinoglicano y xantana contienen de forma natural piruvato. Con nuestro piruvato-ensayo tanto de estos polímeros fueron correctamente identificados. En escleroglucano, goma welan y piruvato xilano también se detectó en cantidades significativas. En general, la capacidad del enfoque fue validado y la piruvato-ensayo showed un alto rendimiento. Se demostró que es capaz de detectar piruvato en diferentes polímeros después de la hidrólisis.
huella digital de hidratos de carbono: Después de realizar todos los módulos de análisis en la detección automatizada, se seleccionaron los productores potenciales de BPA para el análisis de carbohidratos de huellas digitales. Para esto, se aplicaron varios criterios: 1) la observación positiva de la viscosidad después de la centrifugación y / o después de la filtración. 2) Precipitación antes y después de la filtración. fibras observadas y las escamas se evaluaron como positiva. 3) El valor equivalente de la glucosa a partir del método de fenol-ácido sulfúrico. Valores> 700 mg / L se calificaron como positivo y los valores entre 300 y 700 mg / L fueron calificados como productores EPS putativos. Cuando se evaluaron dos o tres criterios como positivos, se seleccionaron las cepas para análisis de huella digital de hidratos de carbono. Los criterios pueden ser personalizados hacia el objetivo individual de la proyección EPS (por ejemplo, EPS de baja viscosidad). Nuestro enfoque dirigido a la búsqueda de efficient EPS productores. Durante la búsqueda de cepas que sólo producen pequeñas cantidades de EPS del límite de evaluación de la glucosa equivalente debe ser reducida.
beneficio técnico y aplicaciones futuras: Una característica interesante de este protocolo es el carácter modular de los pasos y los diferentes módulos analíticos. Se pueden combinar de diferentes maneras, ajustado a las necesidades individuales y nuevos módulos pueden implementarse fácilmente. Además, los módulos de análisis se pueden utilizar por separado, por ejemplo, el módulo de hidrólisis en combinación con el módulo de HT-PMP-derivatización es capaz de realizar un análisis de la composición monomérica de diferentes soluciones de polímero (1 g / l) en formato de 96 pocillos. Para los laboratorios sin tener acceso a un sistema de tratamiento de líquidos de la proyección completo pueda ser manipulado manualmente sin ningún cambio en el esquema de pipeteo. Sin embargo, usando un sistema de manejo de líquidos aumenta el rendimiento de hasta 768 cepas (en lugar de 192 cepas si Screened manualmente) por día. El protocolo que se describe aquí es capaz de una detección de diferentes géneros y, por lo tanto, para el cribado de grandes colecciones de cepas para identificar nuevos productores EPS y analizar su huella digital de hidratos de carbono en un enfoque (Figura 4). Por otra parte, una proyección dirigida para polisacáridos que contienen azúcares raras como fucosa, ácidos urónicos o incluso azúcares desconocidos se puede realizar a través del análisis de monosacárido detallada. Además, diferentes combinaciones de azúcar en proporciones definidas pueden ser detectados. Esto permite la sencilla identificación de variantes estructuralmente relacionados de EPS ya conocidos o nuevos EPS.
The authors have nothing to disclose.
We sincerely thank Thomas Howe and Jörg Carsten for the programming and technical support with the liquid handling systems.
96 well deep well plate 2.0 mL (DWP) | Greiner Bio-One | 780271 | Main-culture (CP 1-1 to 1-4), equilibration plates for gel-filtration (CP 1-6, 1-7, 2-6 and 2-7), 1:100 dilution for the glucose assay (CP 4-1 to 4-4) containing 990µl of ddH2O |
Breathable Sealing Film | Axygen | BF-400-S | Incubation film for pre- and main-culture DWP |
Aluminum Sealing Film | Axygen | PCR-AS-200 | -80 °C storage film for glycerol-stock plates |
MCA96 Nested Disposable Tips 200 µl | TECAN | 30038619 | Worktable position (WTP 2-1 to 2-4) |
A/B glass-filter-plate 1µm | Pall Corporation | PN 8031 | Stored on collector plate (CP 2-1 to 2-4) |
96-well micro titer plate V-Bottom | Greiner Bio-One | 651201 | Collector plate for filtration plate (CP 2-1 to 2-4) |
96-well SpinColumn G-25 | Harvard Apparatus | 74-5612 | Stored on washing DWP (CP 1-6, 1-7, 2-6 and 2-7) |
96-well micro titer plate V-Bottom | Nunc | 249944 | Collector plate for gel-filtration plate (CP 3-1 to 3-4) |
Nested Disposable Tips SBS 50 µl tips | TECAN | 30038609 | Carousel position (CP 4-6, 4-7 and 5-1 to 5-6) |
Trough 250 ml | Axygen | Res-SW96-HP | Water WTP 1-1, Glucose assay reagent-mix WPT 1-2, ammonium-acetat buffer pH 5.6 (CP 5-7) |
96-well micro titer plate F-Bottom (MTP) | Greiner Bio-One | 655101 | precipitation 1 (CP 6-1 to 6-4), pH-value (CP 7-1 to 7-4), precipitation 2 (CP 8-1 to 8-4), phenol-sulfuric-acid method (CP 8-5 to 8-8), glucose-assay (CP 9-1 to 9-9), dummy plates (WTP 3-1, 3-2) |
96-well silicon cap mat | Whatmann | 7704-0105 | Cover mat for MTP |
200 µl pipette tips | Sarstedt | 70.760.002 | For manually handling |
1000 µl pipette tips | Sarstedt | 70.762 | For manually handling |
96-well-PCR micro titer plate | Brand | 781350 | Hydrolysis, PMP-derivatisation |
TPE (thermoplastic elastomer) cap mat | Brand | 781405 | Hydrolysis, PMP-derivatisation |
Filter plate 0.2 µm Supor, | Pall Corporation | PN 8019 | Filtration of samples for UHPLC-ESI-MS analysis with a MTP collector plate |
Pipette Tips LHS 5-300 µl | Brand | 732150 | Brand LHS system |
ABTS (2.2-azino‑bis-(3‑ethylbenzthiazoline)-6-sulfonic acid) | Sigma-Aldrich | A1888 | Glucose-assay |
Glucose oxidase | Sigma-Aldrich | G2133 | Glucose-assay |
Horseradish peroxidase | Sigma-Aldrich | P6782 | Glucose-assay, pyruvat-assay |
DA-64 (N-(Carboxymethylaminocarbonyl)-4.4'-bis(dimethylamino)-diphenylamine sodium salt) | Wako Chemicals GmbH | 043-22351 | Pyruvat-assay |
Pyruvate oxidase | Sigma-Aldrich | P4591 | Pyruvat-assay |
Potassium phosphate dibasic | Carl-Roth | P749.3 | Pyruvat- and glucose-assay |
Potassium phosphate monobasic | Carl-Roth | 3904.3 | Pyruvat- and glucose-assay |
Thiamine pyrophosphate | Sigma-Aldrich | C8754 | Pyruvat-assay |
Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | 31413 | Pyruvat-assay |
2-Propanol | VWR | 20922.466 | Precipitation |
Phenol | VWR | 20599.231 | Phenol-sulfuric-acid method |
Sulfuric acid | Carl-Roth | 4623.4 | Phenol-sulfuric-acid method |
Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | T6508 | Hydrolysis |
Ammonium solution | Carl-Roth | P093.1 | Hydrolysis, PMP-derivatization |
Ethanol absolut | VWR | 20821.321 | Hydrolysis, PMP-derivatization |
Phenol red | Alfa Aesar | B21710 | Hydrolysis, PMP-derivatization |
1-Phenyl-3-methyl-5-pyrazolone | Sigma-Aldrich | M70800 | PMP-derivatization |
Methanol LC-MS | VWR | 83638.320 | PMP-derivatization |
Acetonitril LC-MS | VWR | 83040.320 | PMP-derivatization |
Acetic acid | Sigma-Aldrich | 338826 | PMP-derivatization, |
Ethanol absolut | VWR | 20821.321 | PMP-derivatization |
Methyl red | Alfa Aesar | 36667 | pH-value |
Robotic liquid handling system | Tecan | Freedom EVO | Worktable setup in Figure 2 |
Liquid handling station LHS | Brand | 709400 | Worktable setup in Figure 2 |
Tip-Adapter | Brand | 709434 | Worktable setup in Figure 2 |
Liquid Ends MC 20-300µL | Brand | 709416 | Worktable setup in Figure 2 |
Adapter 60mm | Brand | 709430 | Worktable setup in Figure 2 |