We report a Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS)-based method to isolate neural stem cells (NSCs) and their progeny from the subventricular zone (SVZ) of the adult mouse brain. Applied to Fluorescence Ubiquitination Cell Cycle Indicator (FUCCI) transgenic mice, it allows the study of cell cycle progression by live imaging.
As células estaminais neurais (NCCC) na zona subventricular dos ventrículos laterais (SVZ) sustentar neurogénese olfactiva durante toda a vida no cérebro de mamíferos. Eles geram sucessivamente células de trânsito amplificando (TAC) e neuroblasts que se diferenciam em neurônios, uma vez que integram os bulbos olfatórios. Emergindo de células activadas fluorescentes (FACS) técnicas permitiram o isolamento de NSCs, bem como seus descendentes e já começaram a lançar luz sobre redes de regulação de genes em nichos neurogênicos adultos. Descrevemos aqui uma separação de células técnica que permite distinguir a seguir e a dinâmica do ciclo celular das populações de células acima mencionados a partir do SVZ adulto com uma lex / EGFR / CD24 coloração tripla. Células isoladas são então banhado como células aderentes para explorar em detalhes a sua progressão do ciclo celular por microscopia de lapso de tempo vídeo. Para este fim, usamos transgénico indicador do ciclo celular de fluorescência Ubiquinação (FUCCI) ratinhos em que as células são vermelho fluorescente durang G 1 fase devido a uma G 1 específico repórter vermelho-CDT1. Este método revelou recentemente que NSC proliferação alongar progressivamente a sua fase G 1 durante o envelhecimento, levando a prejuízo neurogênese. Este método é facilmente transponível para outros sistemas e poderiam ser de grande interesse para o estudo da dinâmica do ciclo celular de células do cérebro, no contexto de patologias cerebrais.
Células-tronco neurais quiescentes (NCCC) são a fonte para a neurogênese adulta 1 e pode converter em seu proliferativa "ativado" formulário expressando EGFR (aNSCs) 2. Uma vez ativado, eles dão origem a células de trânsito amplificando (TAC) 3 e, em seguida neuroblastos que migram para os bulbos olfatórios (OB) através de um tubo de astrócitos e, finalmente, diferenciam em neurônios 4,5. NSC e sua progênie são organizados em "nichos" especializados arquiteturas ao longo dos ventrículos laterais, implicando uma miríade de fatores que controlam a sua proliferação 6. O isolamento e purificação de células neurogénicos SVZ é necessário iluminar a regulação molecular do complexo a sua proliferação, mas mantiveram-se um desafio por um longo período de tempo, devido à ausência de marcadores específicos e técnicas adequadas.
Novas abordagens utilizando citometria de fluxo tornaram possível o isolamento de NSCs e their progênie do adulto SVZ 2,7-11. Usando o marcador de células estaminais LeX 12 juntamente com neuroblastos marcador CD24 13 e um FEG fluorescência para rotular o EGFR em células em proliferação 2, que recentemente desenvolveu uma estratégia de FACS permitindo a purificação de cinco dos principais SVZ populações neurogénicos: quiescentes e activados NSC, TAC, imaturos, bem como migrando neuroblasts 9. Aqui, descrevemos em detalhes esta célula triagem técnica e como uma lex / EGFR / CD24 coloração tripla permitido pela primeira vez o isolamento de ambos os NSCs quiescentes e ativadas.
Embora a neurogênese persistir durante a idade adulta, a produção de novos neurônios diminui drasticamente no envelhecimento cerebral 14. A maioria dos estudos concordam com uma redução progressiva do número de proliferação de células progenitoras no SGZ e SVZ 15-20. As conseqüências não são inócuos como o declínio relativo à idade na neurogênese no SVZ provoca uma diminuição de nneurônios ewborn nos bulbos olfatórios do cérebro envelhecido, levando a prejuízo na discriminação olfativa em camundongos com idade entre 18. Elucidar cinética do ciclo celular de células progenitoras neurais é um passo fundamental para compreender os mecanismos subjacentes à evolução da neurogênese adulta durante o envelhecimento. Estudos recentes investigaram a do ciclo celular e na progressão linhagem de células estaminais neuronais adultas in vitro 21 e in vivo 22, mas nenhum deles teve vantagem de separação de células técnicas e geneticamente codificados sondas do ciclo celular fluorescentes para visualizar as fases do ciclo celular de células isoladas a um nível de uma única célula.
Aqui, descrevemos um protocolo que tira proveito dos ratinhos transgénicos FUCCI em que as células são fluorescentes durante o seu ciclo de célula, permitindo a distinção entre G 1 e SG 2 / H 23 fases. Este protocolo mostra o isolamento como prospectivo de NSC e sua progênie de adulto FUCCI mice combinada com microscopia de lapso de tempo vídeo permite o estudo da dinâmica do ciclo celular em um nível de uma única célula.
A técnica de separação de células aqui descrito permite a discriminação fiável entre NSCs quiescentes, NSCs ativados e os seus estudos de progênies permitindo às suas propriedades e dinâmicas no cérebro adulto 9. Juntamente com a tecnologia FUCCI que permite a visualização da progressão do ciclo celular em células vivas 23, foi desenvolvida uma técnica rápida e eficiente para seguir os L 1 e SG 2 / M fases do ciclo celular a partir de células jovens e adultos do cérebro do rato com idade.
A técnica de separação de células utilizadas no presente protocolo foi o primeiro validado combinação de marcadores que permitem a purificação das cinco principais populações neurogénicos do SVZ 9. Foi também a primeira técnica validada permitindo a distinção de NSCs quiescentes e ativadas. É interessante notar que esta técnica não exige a utilização de ratinhos transgénicos, por si só, o que é necessário quando adaptada para modelos de ratinhos transgénicos such como FUCCI. Desde então, codega et al. 10 usaram uma combinação marcação tripla GFAP-GFP / CD133 / EGFR para distinguir as NSC quiescentes de sua contraparte activada, mas não podem ser adaptados para a tecnologia FUCCI uma vez que requer a utilização de ratinhos transgénicos GFAP-GFP. Mich et al. 11 desenvolveram um / EGFR CD24 estratégia de rotulagem Glast / triplo que compartilha resultados comuns com a técnica utilizada neste estudo 9. Na verdade, uma alta correlação entre Lex e marcadores Glast NSCs já foi observada em Daynac et al. 9 estudar. No entanto, o anticorpo utilizado Glast na técnica Mich et ai. É acoplado a ficoeritrina e, portanto, não pode ser adaptada com a utilização de ratos FUCCI-vermelhos.
Há vários pontos técnicos importantes que requerem atenção antes de classificar células SVZ. Em primeiro lugar, o passo de dissociação é muito importante como o tecido cerebral tem de ser dissociado em células individuais, embora preservando a estrutura emTegrity das proteínas utilizados para a estratégia de marcação de anticorpos. 0,05% de tripsina-EDTA demonstrou ser muito eficaz na distinção entre tecido SVZ 27, mas o antigénio LeX foi encontrado para ser altamente sensíveis uma vez que quase todos LEX-FITC imunofluorescência foi perdido (dados não mostrados). Assim, papaína foi utilizado como foi mais eficiente e menos destrutiva do que outras proteases no tecido cerebral. Além disso, nem LeX nem EGFR nem CD24 foram afetados pelo tratamento papaína. Deve-se notar que a marcação com anticorpos foi alterada se o tratamento com papaína excedeu 15 min. Nós obtivemos ótimos resultados com um tratamento de papaína 10 min associada a uma dissociação mecânica (pipeta cima e para baixo 20 vezes).
O revestimento com poli-D-lisina permite a cultura de células aderentes e a formação de colónias após vários dias em cultura. É agora amplamente aceito que em ensaios in vitro vem com suas limitações 28,29. Recomendamos que determinam apenas o primeiro ciclo celular paraas células submetidas a pelo menos uma subsequente divisão para permanecer tão próximo quanto possível para o fenótipo da célula in vivo.
É importante mencionar que as proteínas geminin (fluorescência verde) e CDT1 (fluorescência vermelha) usado para projetar o sistema FUCCI 23 foram previamente mostrado para ser abundantemente expresso por progenitores neurais durante a neurogênese no início de ratos 30 e no cérebro adulto tecidos 9,25 . Embora o mKO2-hCdt1 (30/120) constructo foi usado, principalmente, no presente estudo a acompanhar a fase G1 com fluorescência vermelha, o uso de ambas as construções [mKO2-hCdt1 (30/120) e MAG-hGem (1/110) ] poderia ser prevista para permitir a visualização das fases principais do ciclo celular (L 1 e SG 2 / H), bem como a G 1 / S de transição 23. A principal desvantagem da imagem de dupla-cor é os conjuntos compatíveis limitadas de fluorescência que ainda podem ser utilizados para a rotulagem de células. Uma solução é a utilização de separatiem colunas. Por exemplo, temos esgotado com sucesso a fracção CD24-positivas a partir de células usando colunas de separação antes de separação de células e live-imagiologia como foi utilizado um anticorpo CD24-PE que compartilhavam o mesmo comprimento de onda de emissão de fluorescência FUCCI-Red 25.
Poucos estudos têm investigado a duração do ciclo celular das populações rato SVZ adultos. O comprimento total do ciclo celular obtidas com a nossa técnica é próxima da estimativa in vitro por Costa et al. 21, mas não foi capaz, pela primeira vez para distinguir as diferentes fases do ciclo celular. Num estudo in vivo, Ponti et al. 22 usado a incorporação de análogos da timidina para determinar a dinâmica de proliferação das diferentes populações de células de SVZ. No entanto, não podiam realizar uma monitorização contínua do ciclo celular nem rastrear as células ao nível de uma única célula. Este poderia ser um problema, uma vez que foi demonstrado que uma forte heterogeneidade existe sagacidadehin uma determinada população de células SVZ 22,25. Nós descrevemos aqui uma alternativa técnica in vitro, fácil de configurar, que permite a imagens ao vivo das fases do ciclo celular de diferentes populações adultas neurogênicas em um nível de uma única célula.
Entendendo a regulação do ciclo celular de células-tronco neurais e progenitores continua sendo um desafio para o desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas no contexto do envelhecimento do cérebro ou patologias. Nosso protocolo pode, assim, ter uma ampla gama de aplicações. No contexto do envelhecimento, essa técnica também poderia ser útil para compreender os efeitos do envelhecimento sobre a diferenciação NSC. De fato, é possível identificar células-tronco / progenitoras neurais que entram diferenciação como a sua intensidade de fluorescência vermelha é distintamente mais elevada 26. Finalmente, pode também ser de interesse para explorar a imagem ao vivo contínuo a um nível de uma única célula para estudar processos celulares a intrínsecos e extrínsecos responsáveis pela linhagem próprogressão de NSCs adultas.
The authors have nothing to disclose.
Somos gratos a C Joubert, V Neuville, V Barroca, J Tilliet e todos os funcionários de instalações para animais; a J e N Baijer Dechamps para separação de células; O. Etienne para a assistência técnica, e A. Gouret por sua assistência administrativa. Citometria de fluxo e separação de células foram realizadas no Citometria de Fluxo de recursos partilhada IRCM, criada por doações de equipamentos de DIM-Stem-Pôle, INSERM, Fondation ARC, e CEA. Este trabalho foi apoiado por subsídios da Electricité de France (EDF). MD tem uma bolsa da La Ligue Contre le Câncer e LM da região Ile-de-France (DIM bioterapias). Marc-André Mouthon e François D. Boussin autoria partes co-sênior.
96-well uncoated glass bottom culture plates | MatTek Corp. | P96G-1.5-5-F | |
µ-Plates 96-well | Ibidi | 89626 | |
Poly-D-Lysine | Millipore | A003E | |
NeuroCult NSC Basal Medium | STEMCELL Technologies | 5700 | |
NeuroCult NSC Proliferation Supplement | STEMCELL Technologies | 5701 | |
Heparin | STEMCELL Technologies | 7980 | |
EGF | Millipore | GF144 | |
FGF-2 | Millipore | GF003 | |
Papain | Worthington | LS003119 | |
EBSS | Invitrogen | 24010-043 | |
L-cysteine | Sigma | C-7352 | |
0.5M EDTA, pH 8.0 | Promega | V4231 | |
DNase I | Sigma | D5025-15KU | |
Trypsin inhibitor type II | Sigma | T9128 | Ovomucoid |
DMEM:F12 medium | Life Technologies | 31330-038 | |
20 µm filter | BD Medimachine Filcon | 340622 | |
Eppendorf microtubes 3810X | Sigma | Z606340-1000EA | |
BSA | Sigma | A1595 | Bovine serum albumin solution |
CD24 phycoerythrin-cyanine7 conjugate [PC7] | Life Technologies | A14776 | Mouse IgM; clone MMA. 1:50 |
CD15/LeX fluorescein isothiocyanate [FITC] – conjugated | BD Biosciences | 332778 | Rat IgG2b; clone M1/69. 1:50 |
Mouse anti-human LeX antibody | BD Pharmingen | 559045 | Mouse IgM; clone MAM. 1:50 |
Alexa647 – conjugated EGF ligand | Life Technologies | E35351 | 1:200; Ax647-conjugated EGF ligand in the text |
CompBeads | BD Biosciences | 644204 | |
MACS LS separation columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | separation columns (in the manuscript) |
Anti-mouse IgM microbeads | Miltenyi Biotec | 130-047-301 | |
Hoechst 33258 | Sigma | 861405 | HO (in the manuscript) |
INFLUX cell sorter | BD Biosciences | FACS sorter (in the text) | |
Nikon A1R confocal laser scanning microscope system attached to an inverted ECLIPSE Ti | Nikon Corp. | confocal laser scanning microscope (in the manuscript) | |
NIS-Elements AR.4.13.01 64-bit software | Nikon Corp. | NIS-Elements software (in the manuscript) | |
Plan Apo VC 20x DIC objective (NA: 0.75) | Nikon Corp. | ||
ECLIPSE Ti thermostated chamber | Nikon Corp. | thermostated chamber (in the manuscript) | |
ImageJ | RBS | ||
FlowJo | Tree Star, Ashland, OR | ||
FUCCI mice | RIKEN BioResource Center, JAPAN | Sakaue-Sawano et al. 2008 |