Medición de Precios de los herbicidas Metabolismo en Dicot malas hierbas con un ensayo extirpados Leaf
Summary
This manuscript describes how herbicide metabolism rates can be effectively quantified with excised leaves from a dicot weed, thereby reducing variability and removing any possible confounding effects of herbicide uptake or translocation typically observed in whole-plant assays.
Abstract
In order to isolate and accurately determine rates of herbicide metabolism in an obligate-outcrossing dicot weed, waterhemp (Amaranthus tuberculatus), we developed an excised leaf assay combined with a vegetative cloning strategy to normalize herbicide uptake and remove translocation as contributing factors in herbicide-resistant (R) and –sensitive (S) waterhemp populations. Biokinetic analyses of organic pesticides in plants typically include the determination of uptake, translocation (delivery to the target site), metabolic fate, and interactions with the target site. Herbicide metabolism is an important parameter to measure in herbicide-resistant weeds and herbicide-tolerant crops, and is typically accomplished with whole-plant tests using radiolabeled herbicides. However, one difficulty with interpreting biokinetic parameters derived from whole-plant methods is that translocation is often affected by rates of herbicide metabolism, since polar metabolites are usually not mobile within the plant following herbicide detoxification reactions. Advantages of the protocol described in this manuscript include reproducible, accurate, and rapid determination of herbicide degradation rates in R and S populations, a substantial decrease in the amount of radiolabeled herbicide consumed, a large reduction in radiolabeled plant materials requiring further handling and disposal, and the ability to perform radiolabeled herbicide experiments in the lab or growth chamber instead of a greenhouse. As herbicide resistance continues to develop and spread in dicot weed populations worldwide, the excised leaf assay method developed and described herein will provide an invaluable technique for investigating non-target site-based resistance due to enhanced rates of herbicide metabolism and detoxification.
Introduction
Resistencia a los herbicidas en las malezas presenta una seria amenaza para la producción mundial de alimentos y fibras 1,2. Actualmente, miles de poblaciones y biotipos resistentes de más de un centenar de especies de malas hierbas en todo el mundo se han documentado y estudiado 3. Un mecanismo importante que confiere resistencia a los herbicidas en las plantas es la alteración de los herbicidas genes y las proteínas diana del sitio, incluyendo mutaciones genéticas que afectan a la cinética de unión de la proteína herbicida o la amplificación del gen diana del sitio 2. Desintoxicación metabólica a través de actividades elevadas de monooxigenasa citocromo P450 (P450) o glutatión S transferasa (GST) enzimas es otro mecanismo que confiere resistencia a herbicidas en las malas hierbas, que es distinta de varias formas de mecanismos basados target-site-2. Resistencia basada en metabólico tiene ramificaciones importantes para si los costos de acondicionamiento físico planta (también conocido como la aptitud sanciones) pueden ser el resultado de las mechanis herbicida de resistenciam, así como sobre la posibilidad de un único mecanismo de desintoxicación para conferir resistencia cruzada o múltiples herbicidas en las poblaciones de malezas 1,2,4. Generalmente, el metabolismo de los herbicidas en las plantas se puede dividir en tres fases distintas 5. Fase I implica la conversión herbicida o de activación, tales como hidroxilación mediada por P450 de anillos aromáticos o grupos alquilo, o por N – o reacciones de desalquilación O-, lo que aumenta la polaridad y herbicida parcial desintoxicación 5,6. De reciente introducción de grupos funcionales en la fase I pueden proporcionar sitios de enlace para la conjugación de glutatión reducido por GST o glucosa por glicosiltransferasas UDP-dependientes en la Fase II de 5,7. Por ejemplo, el principal metabolito inicial de primisulfuron-metil en el maíz es hidroxi-primisulfuron-metil 8, que puede ser metabolizado adicionalmente a hidroxi-primisulfuron-glucósido (Fase II) y luego transportado a la vacuola para el almacenamiento a largo plazo o más metabólica proprocesamiento 5,6 (Fase III).
Rudis (Amaranthus tuberculatus) es una especie anual dicotiledóneas de difícil control de malezas que dificulta la producción de maíz (Zea mays), soja (Glycine max) y el algodón (Gossypium hirsutum) en los Estados Unidos. El alto grado de diversidad genética de rudis se ve facilitada por su biología dioica y de larga distancia polinización por el viento, y una sola planta rudis hembra puede producir hasta un millón de semillas 9. Estas semillas son pequeñas y de fácil propagación, lo que naturalmente dotar rudis con un mecanismo de dispersión efectiva. Rudis muestra germinación continua durante todo el ciclo de cultivo 9, y sus semillas son capaces de germinar después de varios años de inactividad. Rudis es una planta C 4 que posee una tasa de crecimiento superior a la mayoría de las malezas de hoja ancha en los sistemas de cultivo de cultivo 10. Además, numerosas poblaciones rudis son resistentes a múltiples families de herbicidas 3.
Una población de rudis (designado MCR) de Illinois es resistente a la 4-hidroxi-fenilpiruvato dioxigenasa (HPPD) herbicidas -inhibiting 11, tales como mesotriona, así como a la atrazina y la acetolactato sintasa (ALS) herbicidas inhibidores, incluyendo primisulfuron-metil , debido a los mecanismos no basados en meta-sitio 12,13. Una población diferente de rudis designada ACR 14, que es primisulfuron-metil-resistente (debido a una mutación en el gen ALS) y la atrazina resistentes pero sensibles a la mesotriona, y una población rudis designado WCS 14 que es sensible a primisulfuron-metil, mesotriona y atrazina se utilizaron en comparación con MCR en nuestra investigación previa 12 y los experimentos actuales (resumen en la Tabla 1). Los estudios iniciales no detectaron alteraciones en la secuencia del gen HPPD o niveles de expresión, o reducción de la absorción mesotriona, en el MCRpoblación, en comparación con las poblaciones-mesotriona sensibles 12. Sin embargo, los estudios de metabolismo con plantas enteras demostraron niveles significativamente más bajos de herbicida mesotriona padres en MCR en comparación con el ACR y WCS, que se correlacionaban con las respuestas fenotípicas anteriores para mesotriona 11,12.
| Rudis Población | Abreviatura | Fenotipo de Mesotriona | Mecanismo de resistencia mesotriona | Fenotipo de primisulfuron | Mecanismo de resistencia primisulfuron |
| McLean County-resistente | MCR | Resistente | Metabolismo * | Resistente | Metabolismo |
| Adams County-resistente | ACR | Sensithe | – | Resistente | Mutación de destino de las instalaciones en la ELA 14 |
| Wayne County-Sensible | WCS | Sensible | – | Sensible | – |
* Mecanismos de resistencia no-objetivo del sitio, excepto el metabolismo mejorado, también pueden conferir resistencia mesotriona en la población MCR 12.
Tabla 1: Descripción de la población rudis de Illinois utilizados en este estudio.
Además de determinar las tasas de metabolismo de los herbicidas en las plantas de semillero rudis intactas, un enfoque experimental diferente fue desarrollado y empleado en nuestra investigación anterior para investigar el metabolismo mediante el uso de un ensayo extirpado rudis hoja 12, así como diversos inhibidores de P450 (por ejemplo, tetcyclacis y malatión). Este método fue adaptado específicamente para rudis de un Previous investigación del metabolismo primisulfuron-metil en el maíz extirpado hojas 15, puesto que el ensayo de la hoja extirpada aún no había sido reportado para la realización de investigaciones metabolismo de los herbicidas en una planta dicotiledónea. El insecticida malatión organophophosate se ha utilizado con frecuencia para in vivo y en la investigación herbicida metabolismo vitro para indicar la participación P450 16. Por ejemplo, la tolerancia y el rápido metabolismo de mesotriona en el maíz se deben a la hidroxilación del anillo catalizado-P450, que se verifica cuando el malatión aumento de la sensibilidad de maíz a la mesotriona 17. Del mismo modo, el malatión inhibe el metabolismo del inhibidor primisulfuron-metil ALS en el maíz extirpado deja 15. Una ventaja importante de la técnica de hoja extirpada es que los datos generados son independientes de los patrones de translocación planta entera, un factor importante a considerar al evaluar el metabolismo de los herbicidas de postemergencia, sistémicas en las plantas. Por consiguiente, este método permite cuantitativa ymetabólica análisis cualitativos para centrarse en una sola hoja tratada 12.
Una estrategia de clonación vegetativa, en combinación con el protocolo de hoja extirpada, se utilizó previamente en rudis para llevar a cabo estudios de metabolismo 12. Debido a la naturaleza cruzamiento de rudis (varón separado y plantas femeninas), y en gran medida de la diversidad genética dentro de las especies de Amaranthus dioicas 9, este protocolo garantiza que se analizaron las plántulas rudis genéticamente idénticos dentro de los experimentos de tiempo-por supuesto. Este artículo demuestra la utilidad del método de la hoja extirpada para medir las tasas de metabolismo de los herbicidas en una mala hierba dicotiledónea (rudis). La cantidad de herbicida matriz restante se determinó en cada punto de tiempo (Figura 1) por análisis de regresión de mínimos cuadrados no lineal, y se ajuste con una curva de primer orden sencillo con el fin de estimar el tiempo para 50% de herbicida absorbido para degradar ( DT 50). Representativocromatogramas de cromatografía líquida de alta resolución en fase inversa (RP-HPLC) se muestran para ALS-resistentes y poblaciones rudis -sensibles, que indican la desaparición de los herbicidas de los padres y la formación concomitante de metabolito polar (s) durante un estudio de evolución temporal (Figura 2). El objetivo de nuestro artículo es describir y demostrar la utilidad de la prueba de la hoja extirpado en combinación con un método de clonación vegetativa para la determinación de las tasas precisas y reproducibles del metabolismo de los herbicidas en plantas dicotiledóneas, utilizando el anillo marcado (URL- 14 C) herbicidas uniformemente en tres poblaciones rudis que difieren en sus respuestas a la planta entera HPPD- y herbicidas inhibidores de ALS (Tabla 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
El método de hoja extirpada descrito en este documento se ha utilizado anteriormente en la investigación del metabolismo primisulfuron en hojas de maíz 15, pero nuestros resultados demuestran que este protocolo también es eficaz, preciso y reproducible para medir el metabolismo de los herbicidas en una especie de maleza dicotiledóneas 12. Una ventaja importante de la técnica de hoja extirpada en comparación con los estudios de la planta entera es que una hoja extirpada es independiente de lo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Wendy Zhang, Austin Tom, Jacquie Janney, Erin Lemley, and Brittany Janney for assistance with plant growth and extractions, Dr. Anatoli Lygin for assistance with chromatographic analyses, and Syngenta Crop Protection for funding.
Materials
| Agar | Sigma-Aldrich | A1296 | for pre-germinating seeds |
| Potting medium | Sun Gro Horticulture | 49040233 | for plant growth |
| Nutricote | Agrivert | TOTAL BLEND 13-13-13 T100 | slow-release fertilizer |
| Growth chamber E15 | Controlled Environments Limited | 20207 | plant culturing |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-500 | buffer for excised leaves |
| HCl (concentrated) | Fisher Scientific | A144500 | adjust pH of buffer |
| Murashige and Skoog (MS) salts | Sigma-Aldrich | M0404 | incubation of excised leaves |
| Methanol | Fisher Scientific | A452-4 | leaf washes after incubation |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 179124 | plant extractions |
| Acetonitrile (HPLC grade) | Macron Fine Chemicals | MKH07610 | HPLC mobile phase |
| Formic acid | Mallinckrodt Analytical | MK259205 | acidify mobile phase pH |
| Micro-centrifuge | Eppendorf | 5417R | 1.5 or 2.0 mL tubes |
| Centrifuge (temperature controlled) | Eppendorf | 5810R | 15 or 50 mL tubes |
| Polypropylene centrifuge tube | Corning Inc. | 430790 | 15 mL, sterile |
| Rotary evaporator | BÜCHI | R200 | concentrate plant samples |
| Liquid scintillation spectrometry (LSS) | Packard Instruments | 104470 | quantify 14C |
| High-performance liquid chromatography | Perkin Elmer | N2910401 | resolve herbicide metabolites |
| Flow scintillation analyzer | LabLogic System | 1103303 | for HPLC analysis of 14C |
| Hypersil Gold C18 column | Thermo-Scientific | 03-050-522 | reversed phase |
| Ultima-Flo M cocktail | Perkin Elmer | 6013579 | for Flow-scintillation analyzer |
| Scintillation Cocktail (ScintiVerse BD) | Fisher Scientific | SX18 | for LSS; biodegradable |
| Laboratory homogenizer | Kinematica | CH-6010 | homogenize leaf samples |
References
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