Metodi per studiare il ruolo di regolamentazione dei piccoli RNA ribosomiale e di occupazione<em> Plasmodium falciparum</em

Summary

Human microRNAs translocate from host erythrocytes to Plasmodium falciparum parasites. Here, the techniques used to transfect synthetic microRNAs into host erythrocytes and isolate all RNAs from P. falciparum are described. In addition, this paper will detail a method of polysome isolation in P. falciparum to determine the ribosomal occupancy and translational potential of parasite transcripts.

Abstract

La variazione genetica responsabile per l'allele falciforme (HbS) consente eritrociti di resistere alle infezioni da parte del parassita della malaria, P. falciparum. La base molecolare di tale resistenza, che è noto per essere multifattoriale, rimane completamente compresa. Recenti studi hanno trovato che l'espressione differenziale dei microRNA eritrocitari, una volta traslocati in parassiti della malaria, influenza sia regolazione genica e la crescita del parassita. Questi miRNA sono stati successivamente dimostrato di inibire la traduzione dell'mRNA formando un RNA trascritto chimerico con 5 'RNA fusione con sottoinsiemi discreti mRNA parassita. Qui, le tecniche che sono state utilizzate per studiare il ruolo funzionale e putative meccanismo sottostante microRNA eritrocitari sulla regolazione genica e il potenziale di traslazione del P. falciparum, compresa la trasfezione dei microRNA sintetici modificati negli eritrociti di accoglienza, sarà dettagliato. Infine, un metodo polysome gradiente è utilizzato per determinare il grado di Translation di queste trascrizioni. Insieme, queste tecniche hanno permesso di dimostrare che i livelli di microRNA sregolati eritrocitari contribuiscono alla cella-intrinseca resistenza della malaria di eritrociti falciformi.

Introduction

La malaria, causata da parassiti Apicomplexa del genere Plasmodium, è la malattia parassitaria umana più comune, infettando il mondo circa 200 milioni di persone ogni anno e provocando circa 600.000 morti ^1. Delle cinque specie di Plasmodium che infettano gli esseri umani, il più rilevante per le malattie umane sono P. falciparum e P. vivax, a causa delle loro distribuzioni diffuse e il potenziale di gravi complicazioni di malaria. Il ciclo di vita del parassita della malaria richiede infezione di zanzare e gli esseri umani sia. Quando una zanzara infetta morde un essere umano, i parassiti viaggiano attraverso il flusso sanguigno al fegato, dove si verifica un primo giro di replica. Dopo la rottura merozoiti dal epatociti ospite, infettano vicine globuli rossi, l'avvio di replica sia asessuata o sessuale. La fase asessuata di replica, che dura 48 ore in P. falciparum, è al centro di questo studio in quanto è sia la fonte della maggior Malsintomi Aria e è facilmente ricapitolate in vitro.

Mentre un certo numero di iniziative di salute pubblica, tra cui il miglioramento terapie anti-malarici, hanno in qualche modo ridotto l'impatto della malaria a livello globale, l'emergere continuo di parassiti resistenti ai farmaci rappresenta un problema per gli sforzi di controllo della malaria. Un settore che può suggerire nuovi approcci terapeutici è lo studio su come le varie varianti genetiche conferiscono resistenza alla malaria. Nelle regioni la malaria è endemica, una varietà di polimorfismi eritrocitari sono abbastanza comuni ^2,3. Queste mutazioni, con falciforme è forse il più importante, sono spesso associati con notevole resistenza alla insorgenza di infezione malarica sintomatica ^4. I meccanismi alla base con cui essi provocano eritrociti di resistere alle infezioni di malaria non sono completamente compresi. Eritrociti parassitato con mutazioni di emoglobina sono soggetti a una maggiore fagocitosi attraverso la rigidità cellulare aumentata e la disidratazione, cheè associato con una diminuzione invasione da parte di P. Plasmodium ^5. L'allele HbC colpisce anche l'espressione della proteina sulla superficie degli eritrociti e con il rimodellamento del citoscheletro, inibendo l'ulteriore sviluppo del parassita ^6,7. Infine, P. falciparum cresce poco all'interno falce omozigote (HbSS) eritrociti ^8,9 in vitro, suggerendo intrinseci fattori eritrocitari di resistenza della malaria. Tuttavia, mentre tutti questi meccanismi sembrano svolgere un ruolo, non spiegano appieno i meccanismi alla base della resistenza falciforme alla malaria.

Un potenziale serie di fattori eritrocitari che rimangono poco conosciuta è la grande piscina di miRNA presenti all'interno eritrociti maturi. I microRNA sono piccoli RNA non codificanti, 19-25 nt in termini di dimensioni, che mediano la traduzione e / o la stabilità di mRNA bersaglio per appaiamento delle basi nel 3 'UTR. Essi sono stati implicati nel controllo delle risposte immunitarie di mammiferi, compreso la soppressione oreplicazione del virus F ^10, e hanno mostrato di conferire resistenza ai virus delle piante Essi hanno anche dimostrato di regolare i diversi processi eritrocitari, tra cui l'eritropoiesi ^11,12 e metabolismo del ferro ^13. Precedenti studi identificato una popolazione abbondante e diversificata di miRNA eritrocitari, la cui espressione è stata drammaticamente alterata in HbSS eritrociti ^14,15. Poiché eritrociti maturi manca la trascrizione attiva e la traduzione, il ruolo funzionale di questi miRNA eritrocitari rimane poco chiaro. Come si verifica un notevole scambio di materiale tra la cellula ospite e P. falciparum durante il ciclo di sviluppo intraerythrocytic (IDC) ^16, è stato ipotizzato che il profilo di miRNA alterato secondo eritrociti HbS può contribuire direttamente alla resistenza della malaria cellule intrinseco.

Questi studi infine portato allo sviluppo di una pipeline per isolare, identificare e funzionalmente studiare il ruolo di miRNA umano all'interno malaria parassita, P. falciparum, che ha indicato che questi ospitano / miRNA umani in ultima analisi, in modo covalente fusibile e quindi translationally reprimono trascritti parassita mRNA ^17. Questo ha fornito un esempio dei primi cross-specie trascritti chimerici formati da trans-splicing e implica che questa fusione miRNA-mRNA potrebbe essersi verificato in altre specie, tra cui altri parassiti. Tutti mRNA trypanosome sono trans-impiombato con una giunta-capo (SL) per regolare la separazione delle trascrizioni policistronici ^18. Poiché P. falciparum manca ortologhi per Dicer / Ago ^19,20, è possibile che i miRNA eritrocitari dirottare simile macchinario SL in P. falciparum per integrare nelle geni bersaglio. Recenti studi in P. falciparum hanno infatti indicato la presenza di sequenze 5 'splice capo ^21. Dettagli Questo studio i metodi che hanno portato alla scoperta di trascritti di fusione umani-parassita miRNA-mRNA, tra cui sia trascrittomica e TRADUCEzionali tecniche di regolazione. Gli obiettivi generali di questi metodi sono per studiare gli effetti di piccoli RNA nella regolazione genica, fenotipi e la traduzione potenziale di P. trascrizioni falciparum.

L'identificazione iniziale di trascritti chimerici umano-parassita invocata l'utilizzo di tecniche di analisi di RNA, come la real-time PCR, il sequenziamento del trascrittoma e la cattura biblioteca EST, che includeva sia totali e piccoli RNA, piuttosto che con tecniche che isolati solo piccoli RNA. Isolando tutto RNA insieme in una grande piscina, piuttosto che separatamente, permesso di individuare i piccoli RNA umani traslocati nel parassita, nonché la presenza di queste piccole sequenze di RNA come parte di una sequenza più ampia. Questo poi ricorso ad analisi dello stato di questi mRNA traduzione fusione per determinare le conseguenze funzionali di tali fusioni.

Mentre ampi sforzi sulla caratterizzazione del genoma del parassita und trascrittoma hanno aggiunto alla comprensione della biologia del parassita ^22-25, molto meno si sa circa la regolamentazione di traslazione del trascrittoma mRNA attraverso il ciclo di vita di P. falciparum ^26. Questa comprensione limitata del proteoma del parassita ha ostacolato sia la comprensione della biologia del parassita e la capacità di identificare nuovi obiettivi per la prossima generazione di terapie contro la malaria. Questo divario nella comprensione della biologia cellulare del parassita ha persistito in gran parte a causa della mancanza di tecniche adeguate per svolgere indagini regolazione traduzionale in P. falciparum. Un recente documento descritto l'uso di footprinting ribosomiale di P. falciparum per determinare lo stato di traduzione globale ^21. Una misura ben consolidata del potenziale traslazionale delle trascrizioni è il numero di ribosomi associati determinati da polysome profiling. Tuttavia, quando questa tecnica è applicata a P. falciparum </ em>, è in grado di recuperare la maggior parte dei polisomi e cattura prevalentemente monosomes. Recentemente, diversi gruppi hanno ottimizzato ^27,28 P. Tecniche polysome falciparum di lisi degli eritrociti e parassiti simultaneamente per preservare i polisomi e caratterizzare l'occupazione ribosomiale e il potenziale traslazionale di questi parassiti della malaria durante il loro sviluppo asessuale in ospitanti globuli rossi ^28.

Collettivamente, questi metodi dimostrano che la fusione osservato di miRNA e parassiti mRNA umani modula traduzione proteine ​​parassita di quelle mRNA di fusione, che è stato dimostrato utilizzando metodi precedentemente riportati ^27, ed è un fattore determinante della resistenza della malaria in HBA e HbSS eritrociti ^17. Questi metodi potrebbero essere utili in qualsiasi sistema cerca di individuare e funzionalmente esplorare eventi RNA splicing, se tali RNA di fusione sono in P. falciparum o altri sistemi eucariotici.

Protocol

1: Isolamento di RNA di piccole dimensioni da P. falciparum Durante l'IDC Ottenere i parassiti della malaria nella cultura asessuata 29. NOTA: La dimensione culturale necessaria varierà in base alla applicazione desiderata; tuttavia, una cultura 10 ml al 3-5% parassitemia e 5% ematocrito offre ampio RNA per PCR in tempo reale (RT-PCR). La tecnica è stata inizialmente ottimizzato per le culture asincrone, ma quando si desiderano punti temporali specifici durante il ciclo di inf…

Representative Results

Profilazione globale di microRNA umana in P. falciparum Le tecniche qui presentate sono stati usati per estrarre microRNAs parassitari in una varietà di condizioni. Una cosa da notare è che le estrazioni di RNA per i globuli rossi infetti sono stati effettuati, come indicato nel 32, che spesso serviva come punto di riferimento per i dati microRNA presentati sia in questo articolo e lo studio originale 29. Tali studi precedenti hanno anche dimostrato …

Discussion

HBS è una delle varianti di emoglobina più comuni in aree endemiche malaria, principalmente perché fornisce protezione contro la malaria causata da P. grave falciparum. Le tecniche necessarie per caratterizzare il ruolo di microRNA umano nella regolazione genica di P. falciparum sono dettagliate nel corso di questo manoscritto. Estraendo RNA totale in modo tale da includere tutti i piccoli RNA, ed eseguendo una procedura parassita lisi relativamente semplice, questi RNA fusione potevano ess…

Materials

REAGENTS-All reagents must be RNAse-free.

Diethyl pyrocarbonate (DEPC; Sigma, cat. no. D5758)

DEPC-treated water (see REAGENT SETUP)

Yoyo-1 DNA fluorescent dye (Thermo Fisher)

Gene Pulser II (or comparible) electroporator (Bio-Rad)

0.2 cm Electroporation cuvettes

4 M potassium acetate (Mallinckrodt, cat. no. 6700)

2 M potassium HEPES (pH 7.2; Sigma, cat. no. H0527)

1 M magnesium acetate (Sigma, cat. no. M-2545)

1 M dithiothreitol (DTT; Research Products International, cat. no. D11000)

100 mM phenylmethylsulfonate fluoride (PMSF; dissolved in isopropanol; Sigma, cat. no. P7626)

10% (v/v) Igepal CA-630 (Sigma-Aldrich, cat. no. I3021)

10% (w/v) sodium deoxycholate (DOC; Sigma, cat. no. D-6750)

Cycloheximide (CHX; Sigma, cat. no. C-7698)

Sucrose (Mallinckrodt, cat. no. 8360-04)

RNAseOUT (Invitrogen, cat. no. 100000840)

RPMI-1640 w/ L-glutamine (Cellgro, cat. no. 10-040-CV)

10% AlbuMAX I (w/v in sterile water) (Invitrogen, cat. no. 11020-039)

Gentamicin (Gibco, cat. no. 15750-060))

HT supplement (100x) (Invitrogen, cat. no. 11067030)

45% (w/v) sucrose (Sigma, cat no. G8769)

1 M HEPES buffer (Gibco, cat. no. 15630-080)

1x phosphate buffered saline (PBS; Cellgro, cat. no. 2109310CV)

Corning 500 ml vacuum filter flask (VWR, cat. no. 430769)

Glass slides (VWR, cat. no. 48311-702)

Giemsa stain (50X) (VWR, cat no. m708-01)

mirVana miRNA isolation kit (Ambion, ThermoFisher Scientific).

5' Biotin conjugated mature miRNA (sequence varies by miRNA of interest) (Dharmacon)

Biotin powder (Sigma-Aldrich)

1M Potassium Chloride

Streptavidin Sepharose High Performance Beads (GE Healthcare)

Ribosome resuspension buffer (see REAGENT SETUP)

Lysis buffer (see REAGENT SETUP)

15% (w/v) sucrose gradient solution (see REAGENT SETUP)

50% (w/v) sucrose gradient solution (see REAGENT SETUP)

0.5 M sucrose cushion (see REAGENT SETUP)

60% (w/v) sucrose chase solution (see REAGENT SETUP)

Plasmodium cell culture media (see REAGENT SETUP)

RNA capture Wash Buffer (see REAGENT SETUP)

RNA Elution Buffer (see REAGENT SETUP)

REAGENT SETUP

Solutions

Plasmodium cell culture media

500 ml RPMI-1640 w/ L-glutamine

0.5 ml gentamicin

5 ml HT supplement

2.5 ml 45% glucose

25 ml 10% AlbuMAX I

12.5 ml 1 M HEPES

Sterile filter with 0.2 mm vacuum filter flask.

Plasmodium cell culture media containing 10x CHX

Same recipe as Plasmodium cell culture media above, with the addition of:

2 mM cycloheximide

Media is prepared as normal, then add CHX to a final concentration of 2 mM and filter.

1x PBS containing cycloheximide

Cycloheximide is added fresh to 1x PBS to a final concentration of 200 mM, and kept at 4 OC until use.

Ribosome resuspension buffer

400 mM potassium acetate

25 mM potassium HEPES, pH 7.2

15 mM magnesium acetate

200 mM cycloheximide (add fresh)

1 mM DTT (add fresh)

1 mM PMSF (add fresh)

40 U/ml RNaseOUT (add fresh)

Lysis buffer

Same recipe as ribosome resuspension buffer above, with the addition of:

1% (v/v) Igepal CA-630

0.5% (w/v) DOC

Sucrose solutions

Same recipe as ribosome resuspension buffer above, with the addition of varying amounts of sucrose:

15% (w/v) sucrose to make 15% sucrose gradient solution

50% (w/v) sucrose to make 50% sucrose gradient solution

0.5 M sucrose to make 0.5 M sucrose cushion

As above, cycloheximide, DTT, PMSF, and RNaseOUT must be added fresh.

The 60% sucrose chase solution requires only sucrose and water, no other components

60% (w/v) sucrose in DEPC-treated water to make 60% sucrose chase solution

RNA Capture Wash Buffer

20mM  KCl

5unit/ml Rnase Out (Invitrogen)

RNA Capture Elution Buffer

Same recipe as RNA Capture Wash Buffer, with the addition of:

2mM Biotin

EQUIPMENT

SW55 Ti ultracentrifuge rotor (Beckman, cat. no. 342194)

SW41 Ti ultracentrifuge rotor (Beckman, cat. no. 331362)

Ultra-ClearTM ½ x 2 in (13 x 51 mm) ultracentrifuge tubes for the SW55 (Beckman, cat. no. 344057)

Polyallomer 9/16 x 3 ½ in (14 x 89 mm) ultracentrifuge tubes for the SW41 (Beckman, cat. no. 331372)

L8-80M ultracentrifuge (Beckman)

Steel blunt syringe needle, 4 inch, 16G (Aldrich, cat. no. Z261378)

1 ml syringe with 27G½ needle (Becton Dickinson, cat no. 309623)

5 ml syringe (Becton Dickinson, cat. no. 309646)

Parafilm

Tube rotator, end-over-end

Microcentrifuge, refrigerated

Density gradient fractionation system (Teledyne Isco, cat. no. 69-3873-179)

TracerDAQ (Measurement Computing)

Eppendorf 5810R centrifuge

Eppendorf A-4-81 rotor (Eppendorf, cat. no. 022638807)