In this study we present an in vitro culture system that can efficiently generate pDCs by co-culturing common lymphoid progenitors with AC-6 feeder cells in the presence of Flt3 ligand.
Плазмоцитов дендритные клетки (PDCs) являются мощным типа интерферона (ИФН-I), производящие клетки, которые активируются в ответ на инфекцию или во время воспалительных реакций. К сожалению, исследование функции PDC препятствует их низкой частоты в лимфоидных органах, а существующие методы экстракорпорального поколения DC преимущественно в пользу производства CDCs над PDCs. Здесь мы представляем уникальный подход эффективно генерировать PDCs из общих лимфоидных клеток-предшественников (CLPS) в пробирке. В частности, протокол, описанный подробно, как очистить CLPS из костного мозга и генерировать PDCs по сокультивировани гамма-облученной АС-6 фидерных клеток в присутствии лиганда Flt3. Уникальной особенностью этой системы культуры является то, что CLPS мигрировать под AC-6 клеток и стать булыжником площадь формирования клеток, важным шагом для расширения PDCs. Морфологически различные контроллеры домена, а именно PDCs и CDCs, были получены примерно через 2 недели с составом 70-90% PDCs в оптимальных условиях. Как правило, количество генерируемых PDCs этим методом, примерно в 100 раз количества CLPS семенами. Таким образом, это новая система, с которым решительно генерировать большое количество PDCs, необходимых для облегчения дальнейших исследований в развитие и функции этих клеток.
Дендритные клетки (ДК) являются профессиональными антиген-представляющими клетками, которые играют важную роль в регулировании иммунного ответа 1. В то время как контроллеры домена являются гетерогенными, они могут быть классифицированы на две популяции, обычный РС (CDCs) и плазмоцитов ДК (PDCs) 2,3. В дополнение к лимфоидных органов, CDCs и PDCs также найдены в тканях, включая легкие, кишечник и кожу 2. Морфология CDCs и PDCs отличается, с CDCs проявляющих дендритных-выступы и форма PDCs быть более плазмы клеток, как. Кроме того, общий мыши округ Колумбия, CD11c, более высокий уровень экспрессии на CDCs чем на PDCs. Кроме того, CDCs может быть разделен на CD11b + CD24 – CDCs и CD11b – CD24 + CDCs, оба из которых выражают более высокие уровни МНС класса II и молекулы костимулирующих чем сделать PDCs 2. Зрелые PDCs, с другой стороны, было показано, что выборочно выразить Siglec-H и BST2 4. Functionally, CDCs являются лучшими антиген-представляющих клеток, чем PDCs; Однако, PDCs может производить огромное количество типов интерферона на вирусной инфекции или воспалительных стимуляции 5.
Оба CDCs и PDCs недолговечны, и, следовательно, должны быть постоянно пополняется из предшественников в костном мозге (ВМ) 6,7. Приемных передачи общих миелоидных клеток-предшественников (CMPS) и общих предшественников лимфоидных (CLPS) в смертельно облученных мышей-показывает, что CDCs и PDCs могут быть получены из обеих линий 8-10. Тем не менее, есть подмножество PDCs, выражающих RAG1 / 2 и обладают переставить DJ сегменты на IgH локуса 11,12. Эти клетки также поделиться молекулярные сходства с В-лимфоцитами, в том числе выражения B220 маркера, кислоты зондирования рецепторов нуклеиновых (TLR7 / TLR9), и транскрипционных факторов (SPIB и Bcl11a) 13, имеет все полагают, подписи лимфоидной линии. Таким образом, CLPс может быть хорошим выбором для поколения в пробирке PDCs из-за сходства клонов.
В то время как частота обоих CDCs и PDCs у человека и мышей очень низка 6, ДК, в частности CDCs, могут быть получены в лабораторных от BM или предшественников в присутствии цитокинов, таких как GM-CSF или 11,14 Flt3 лиганда (FL ) с использованием фидерных систем без 11,15,16. К сожалению, однако, это не возможно, чтобы произвести большое количество PDCs в пробирке с использованием FL 11,15,16. Ранее мы показали, что PDCs может быть эффективно генерируется в пробирке из CLPS с использованием системы АС-6 подачи 17. Преимущество использования стромальных клеток линии АС-6 в системе культуры в том, что оно обеспечивает контакт клетка-клетка и секреции цитокинов, которые поддерживают генерацию большого количества PDCs от CLPS. Хотя производство этой системы вполне надежный, заботливый репликации из процедур, описанных ниже, обязательны Яп Для того чтобы обеспечить эффективную генерацию PDCs.
Здесь мы опишем в пробирке культуру систему для надежной генерации ДК и PDCs в частности, из небольшого числа CLPS. Уникальность этой системы культуры связано с использованием АС-6 клеток, в стромальных клеток линии, как питатели. Этот подход был показан, чтобы обеспечить не только цито…
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарны д-ра. Маркус Манц и Ирвинг Вайсман для обеспечения реагентов. Мы также признаем, услугу, предоставляемую на проточной цитометрии анализа и сортировки клеток ядра фонда Первого и Второго центральной лаборатории Национального университета Тайваня Медицинского колледжа и больницы НТУ, соответственно. Эта работа была поддержана Министерством науки и технологий, Тайвань (МОСТ 102-2320-B-002-030-MY3) и национальные медицинских исследовательских институтов, Тайвань (НПУ-EX102-10256SI и НПУ-EX103-10256SI).
Anti-mouse Ly6g/Ly6c (PE), clone RB6-8C5 | Biolegend | 108408 | linage marker |
Anti-mouse NK1.1 (PE), clone PK136 | Biolegend | 108708 | linage marker |
Anti-mouse CD11b (PE), cloneM1/70 | Biolegend | 101208 | linage marker |
Anti-mouse CD19 (PE), clone eBio1D3 | Biolegend | 115508 | linage marker |
Anti-mouse B220 (PE), clone RA3-6B2 | Biolegend | 103208 | linage marker/FACS |
Anti-mouse CD3 (PE), clone 17A2 | Biolegend | 100308 | linage marker |
Anti-mouse CD8a (PE), clone 53-6.7 | Biolegend | 100707 | linage marker |
Anti-mouse MHC-II (PE), clone NIMR-4 | Biolegend | 107608 | linage marker |
Anti-mouse Ter119 (PE), clone TER-119 | Biolegend | 116208 | linage marker |
Anti-mouse Thy1.1 (PE), clone HIS51 | eBioscience | 12-0900-83 | linage marker |
Anti-mouse M-CSFR (APC), clone AFS98 | Biolegend | 135510 | FACS |
Anti-mouse c-Kit (PerCP/Cy5.5), clone 2B8 | Biolegend | 105824 | FACS |
Anti-mouse Sca-1 (FITC), clone D7 | Biolegend | 108106 | FACS |
Anti-mouse IL-7Ra (PE/Cy7), clone A7R34 | Biolegend | 135014 | FACS |
Anti-mouse CD11c (PerCP/Cy5.5), clone N418 | Biolegend | 117328 | FACS |
Anti-mouse CD11b (FITC), clone M1/70 | Biolegend | 101206 | FACS |
FACSAria III | BD Biosciences | Cell sorter | |
FACS sorting tube | BD Biosciences | 352054 | |
FlowJo | FlowJo LLC | Flow analysis sofrware |