تروية دقيقة التقنية المعنية بالتحقيق في تنظيم Microvessel النفاذية في الفئران مساريق
Summary
The modified Landis technique enables paired measurement of the hydraulic conductivity of individual microvessels in the mesentery of normal and genetically modified rats under control and test conditions using microperfusion techniques. It provides a convenient method to evaluate mechanisms that regulate microvessel permeability and transvascular exchange under physiological conditions.
Abstract
تجارب لقياس خصائص نفاذية microvessels perfused بشكل فردي توفر جسرا بين التحقيق في الآليات الجزيئية والخلوية تنظيم نفاذية الأوعية الدموية في تربيتها الطبقات الوحيدة الخلية البطانية وخصائص الصرف الوظيفية للأسرة بأكملها الاوعية الدموية الدقيقة. ووصف طريقة ليقني؛ يدخل القنية ويروي microvessels venular من مساريق الفئران وقياس التوصيل الهيدروليكي للجدار microvessel. المعدات الرئيسية اللازمة تشمل مجهر حيوي داخلي مع مرحلة كبيرة المعدلة التي تدعم micromanipulators وضع ثلاث microtools مختلفة: (1) micropipette مشطوف زجاج ليقني؛ يدخل القنية ويروي microvessel. (2) كوب الصغرى مطبق لمنع عابر نضح وتمكين قياس transvascular حركة تدفق الماء عند الضغط الهيدروستاتيكي قياس، و (3) قضيب زجاج حادة لتحقيق الاستقرار في أنسجة المساريقي في موقع إقناء؛ إدخال القنية. وتعديل لانديس الصغرى انسداد TECHNIQرق يستخدم خلايا الدم الحمراء المعلقة في الإرواء الصناعي كعلامات لحركة السوائل transvascular، وأيضا تمكن يتم التحكم بدقة القياسات المتكررة لهذه التدفقات يتم تغيير الظروف التجريبية كما والهيدروستاتيكي والغروي فرق الضغط الأسموزي عبر microvessels. قياسات التوصيل الهيدروليكي لأول مرة باستخدام الإرواء التحكم، ثم بعد إعادة إقناء؛ إدخال القنية من نفس microvessel مع perfusates اختبار تمكين إقران مقارنات بين استجابة microvessel في ظل هذه الظروف تسيطر عليها بشكل جيد. وكانت محاولات لتمديد طريقة لmicrovessels في مساريق الفئران مع التعديلات الجينية المتوقع أن تعديل نفاذية الأوعية الدموية محدودة للغاية بسبب غياب microvessels طويلة مستقيمة وغير متفرع في مساريق الماوس، ولكن مؤخرا بالاطلاع على الفئران مع التعديلات الجينية مماثلة تستخدم ومن المتوقع أن فتح مجالات جديدة للتحقيق حيث الطرق الموضحة في هذه الوثيقة يمكن تطبيقها على كريسبر التكنولوجيا / Cas9. </P>
Introduction
تروية دقيقة في الأوعية الدموية يستلزم إنشاء تسيطر تدفق وسائل الإرواء الاصطناعي للتكوين المعروفة عبر micropipette في أحد الأوعية الدموية عادة ما تكون أقل من 40 ميكرون في القطر. ولا تزال السفينة perfused ضمن بيئة الأنسجة الطبيعية، ويتم مع perfused الدم حتى الحيوان لوقت إقناء؛ إدخال القنية. عندما تستخدم بالاقتران مع مجموعة من تصوير الفيديو أو تقنيات فلوروميتريك، تروية دقيقة في الموقع يتيح قياس الماء والمذاب التدفقات عبر جدران microvessels في ظل الظروف التي لا يعرف القوى الدافعة لهذه التدفقات وخصائص نفاذية جدار الأوعية الدموية يمكن أن يكون تقييم مباشرة. وعلاوة على ذلك، من خلال التحكم في تكوين السائل المحيط microvessel في الأنسجة (الإرواء وsuperfusate)، وتنظيم نفاذية microvessel وتبادل يمكن التحقيق من خلال تمكين الخلايا البطانية التي تشكل الجدار microvessel أن تتعرض لمجموعة متنوعة من البريدشروط xperimental (منبهات، وظروف نضح تعديلها، مؤشرات لقياس الفلورسنت تكوين الخلايا والإشارات) لفترات قياسها بدقة من الزمن (ثانية إلى ساعة). بالإضافة إلى ذلك، التقييمات التركيبية أو cytochemical الهياكل الجزيئية الخلوية الأساسية التي تنظم حاجز يمكن التحقيق في نفس microvessels التي يقاس نفاذية مباشرة. النهج مما يشكل جسرا بين التحقيق في الآليات الخلوية والجزيئية لتعديل وظيفة حاجز غشائي في تربيتها الطبقات الوحيدة الخلية البطانية والتحقيق في microvessels سليمة. راجع ما يلي استعراض لمزيد من التقييم 1-6.
وجود قيود على تروية دقيقة هو أنه لا يمكن أن تستخدم إلا في سرير الاوعية الدموية الدقيقة التي هي رقيقة وشفافة ولها السلامة الهيكلية كافية لتمكين إقناء؛ إدخال القنية مع micropipette الزجاج. بينما التحقيقات في وقت مبكر تستخدم microvessels الضفدع في مساريق ورقيقة الجلدي الذبحة مuscle 7،8، حتى الآن إعداد الأكثر استخداما في نماذج الثدييات هو مساريق الفئران 9-15. وقد ركزت معظم الدراسات على التغيرات الحادة في نفاذية الأوعية الدموية درس على مدى فترات من 1-4 ساعة، ولكن تم تمديد مزيد من التحقيقات الأخيرة لقياسات على السفن الفردية 24-72 ساعة بعد نضح الأولي 12،16. التكنولوجيا كريسبر وضعت مؤخرا، والتي وعود لجعل نماذج الفئران المعدلة وراثيا أكثر المتاحة لدراسة الأوعية الدموية تنظيم نفاذية 17 ينبغي تمكين الطرق الموضحة في هذه الاتصالات ليتم تطبيقها في microvessels venular من مساريق في هذه النماذج الهامة الفئران الجديدة.
يتطلب أسلوب مجهر مقلوب مجهزة مرحلة المجهر عرف بني كبيرة بما يكفي لاحتواء كل من اعداد الحيوانات وثلاثة على الأقل micromanipulators تستخدم لموقف microtools بالقرب من السفينة perfused ومحاذاة micropipette نضح مع السفينةالتجويف. يمكن على سبيل المثال أن ملفقة منصة مخصصة لمرحلة المجهر XY (حوالي 90 × 60 سم) من مسطحات الصلب 1 سم مع طلاء مقاوم للصدأ. يتم إرفاق مرحلة إلى جدول مؤشر الهندسة أو شريحتين-حمامة ذيل شنت في الزوايا وعلى أعمدة تفلون أو نقل الكرة للحركة في المستوى الأفقي. A تلاعب نموذجي (انظر الشكل 2) لديه الكثير من القواسم المشتركة مع المجهر وmicropositioning المعدات المستخدمة لمجموعة من التجارب دوران الأوعية الدقيقة حيوي داخلي مثل تلك لقياس واحد تدفق الأوعية الدموية والهيماتوكريت، والتسليم الأكسجين المحلي microvessels الدم perfused، وتنظيم الأوعية الدموية على نحو سلس قوة العضلات، وتراكم الاوعية الدموية الدقيقة المحلي لاستشفاف الفلورية حقنها في الدورة الدموية بأكمله. 18-26
الجانب الأساسي من هذه التقنية هو قياس حجم التدفق (J ت) عبر مساحة محددة (S) من الجدار microvessel. لإنجازهذا عبر تقنية انديس تعديل الموصوفة هنا المجهر المقلوب بسيط هو كاف. هي التي شنت كاميرا فيديو صغيرة على المنفذ صورة وإشارة الفيديو، مع قاعدة الوقت المحتسب بدل الضائع، يتم عرضها على شاشة الفيديو وتسجيلها إما في شكل رقمي على الكمبيوتر أو إشارة رقمية أو التناظرية على مسجل الفيديو. بمجرد مقنى وmicrovessel جزء من microvessel مرئية للكاميرا يمكن تغيير عن طريق تحريك خشبة المسرح والمتلاعبين كوحدة دون تعطيل إقناء؛ إدخال القنية.
قياس التدفقات transvascular يمكن أيضا أن تكون جنبا إلى جنب مع التحقيقات أكثر تفصيلا باستخدام مجهر مضان متطورة مع الفلاتر المناسبة مثل الحفارات المستخدمة لقياس نفاذية المذاب، ورصد نسبة الفلورسنت من الكالسيوم حشوية أو الآليات الخلوية الأخرى، ومتحد البؤر التصوير 6،12،13، 27. والميزة الرئيسية لجميع المناهج تروية دقيقة هي القدرة على اتخاذ تدابير المتكررة، على السفينة نفسها، في ظل تغير تسيطر عليها القوة الدافعة مثل الضغوط الهيدروستاتيكي وoncotic، أو تغيير يتسبب في ردود السفينة إلى حالات الالتهابات. التصميم الأكثر شيوعا هو المقترنة المقارنة من قياس التوصيل الهيدروليكي (L ص) على نفس السفينة مع السفينة perfused أولا عن طريق micropipette مليئة الإرواء السيطرة وتعليق الخلايا الحمراء لإقامة دولة نفاذية خط الأساس، ثم مع ماصة الثانية مع وكيل اختبار تضاف إلى الإرواء. cannulations المتعددة ممكنة مع دورة متكررة بعد ضخه مع ماصة السيطرة.
يوضح هذا البروتوكول إقناء؛ إدخال القنية وتروية دقيقة من سفينة venular في مساريق الفئران لتسجيل تدفقات المياه عبر الجدار microvessel وقياس L p من جدار الوعاء الدموي، وهو مؤشر مفيد للنفاذية مسار مشترك للمياه والأملاح عبر سليمة حاجز غشائي. يتم استدعاء الإجراء لانديس TECHNIQ تعديلرق لأن المبدأ لانديس الأصلي من استخدام الحركة النسبية للخلايا الدم الحمراء كإجراء الصرف السائل transvascular بعد حظره هو الحفاظ على 28 التروية، ولكن مجموعة من الظروف التجريبية (على سبيل المثال، فإن الاختلافات ضغط oncotic الهيدروستاتيكي وزلال عبر الجدار microvessel) تتوفر بعد تروية دقيقة هي أكبر بكثير مما كانت عليه في uncannulated الدم perfused microvessels 8،29.
Protocol
Representative Results
Discussion
تفاصيل L الحسابات ص. على الرغم من أن تحدث حركة السوائل transvascular بينما perfused السفينة بحرية، وهذا التبادل هو أبعد ما يكون صغير جدا بحيث لا يمكن قياسها خلال نضح الحرة لأنها عادة ما تكون أقل من 0.01٪ من معدل نضح السفينة. ومع ذلك، عندما نضح توقف عابر التي تسد microvessel، و?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح HL44485 وHL28607.
Materials
| MICROSCOPE, TABLE AND STAGE | |||
| inverted microscope (metallurgical type) with trinocular head for video: example | Olympus | CK-40 | try to place eyepieces higher relative to stage–you have to look through eyepieces while reaching around to top of stage over intervening micromanipulators |
| inverted microscope (metallurgical type) with trinocular head for video: example | Leica | DMIL | try to place eyepieces higher relative to stage–you have to look through eyepieces while reaching around to top of stage over intervening micromanipulators |
| narrow diameter, long working distance objective: example | Nikon | Nikon E Plan 10×/0.25 LWD | |
| stage platform–1/2 inch or 1 cm sheet steel | welding shop | this should be heavy to reduce vibration | |
| Unislide x-y table: dove tail slides | Velmex | AXY4006W1 | |
| VIDEO | |||
| CCD video camera: example | Pulnix | TM-7CN (no longer available) | no color needed |
| video capture system with audio–generic | |||
| video playback system (completely still frame, single frame motion) | |||
| small microphone | |||
| MICROMANIPULATORS, HOLDERS | |||
| micromanipulator, XYZ (3) | Prior/Stoelting (no longer available) | look for fine Z, and larger range of travel in coarse drives for ease of positioning | |
| hydraulic probe drive, one way | FHC | 50-12-1C | need to buy either manual drive or electronic drive |
| manual drum drive | FHC | 50-12-9-02 | |
| or hydraulic drive, 3 way | Siskiyou Corporation | MX610 (1-way) or MX630 (3-way) | great for short arms, water filled and must be sent back for refill ~every 2 years |
| connectors/rods/holders | Siskiyou Corporation | MXC-2.5, MXB etc. | |
| pin vise | Starrett | 162C | to hold restrainer |
| pipette holder | World Prescision Instruments | MPH3 | |
| water manometer ~120 cm | |||
| MICROSCOPE TRAY | |||
| clear Plexiglas for microscope tray for animal | |||
| 3/4 inch polished quartz disc ~1/4 inch tall | Quartz Scientific Inc. | custom | (or polished plexiglass, glass); make sure the height is less than working distance of objective |
| Plexiglas glue (Weld-on 4: CAUTION CARCINOGEN) | |||
| medical adhesive for tissue well | NuSil | MED-1037 | |
| All-purpose silicone rubber heat mat, 5" L x 2" W | Cole Parmer | EW-03125-20 | heater for microscope tray–needs cord and controller–240V version available |
| Power Cord Adapter for Kapton Heaters and Kits, 6 ft, 120 VAC | Cole Parmer | EW-03122-75 | |
| STACO 3PN1010B Variable-Voltage Controller, 10 A; 120 V In, 0-140 V Out | Cole Parmer | EW-01575-00 | |
| PIPET MANUFACTURE | |||
| vertical pipette puller | Sutter Instrument Company | P-30 with nichrome filament | |
| 1.5 mm OD thin wall capillary tubing | Sutter Instrument Company | B150-110-10 | |
| pipette grinder air stone and dissection microscope–see reference in text | or purchase a package from Sutter Instruments or World Precision Instruments | ||
| RX Honing Machine, System II | RX Honing Machine Corporation | MAC-10700 Rx System II Machine | alternative for air stone, use with a dissecting microscope mounted at an angle |
| with ceramic sharpening disc | RX Honing Machine Corporation | use "as is" or attach lapping film | |
| lapping film sheets, 0.3 or 0.5 um | 3M | part no. 051144 80827 | 268X Imperial lapping film sheets with adhesive back–can be purchased from Amazon |
References
- Curry, F. R. Permeability measurements in an individually perfused capillary: the ‘squid axon’ of the microcirculation. Experimental physiology. 93, 444-446 (2008).
- Curry, F. R., Adamson, R. H. Vascular permeability modulation at the cell, microvessel, or whole organ level: towards closing gaps in our knowledge. Cardiovasc Res. 87, 218-229 (2010).
- Curry, F. R., Adamson, R. H. Tonic regulation of vascular permeability. Acta physiologica. 207, 628-649 (2013).
- Michel, C. C. Fluid exchange in the microcirculation. The Journal of physiology. 557, 701-702 (2004).
- Tarbell, J. M., Simon, S. I., Curry, F. R. Mechanosensing at the vascular interface. Annual review of biomedical engineering. 16, 505-532 (2014).
- Sarelius, I. H., Kuebel, J. M., Wang, J., Huxley, V. H. Macromolecule permeability of in situ and excised rodent skeletal muscle arterioles and venules. American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 290, H474-H480 (2006).
- Curry, F. E., Frokjaer-Jensen, J. Water flow across the walls of single muscle capillaries in the frog, Rana pipiens. The Journal of physiology. 350, 293-307 (1984).
- Michel, C. C., Mason, J. C., Curry, F. E., Tooke, J. E., Hunter, P. J. A development of the Landis technique for measuring the filtration coefficient of individual capillaries in the frog mesentery. Q J Exp Physiol Cogn Med Sci. 59, 283-309 (1974).
- Adamson, R. H., Zeng, M., Adamson, G. N., Lenz, J. F., Curry, F. E. PAF- and bradykinin-induced hyperpermeability of rat venules is independent of actin-myosin contraction. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. 285, H406-H417 (2003).
- Huxley, V. H., Rumbaut, R. E. The microvasculature as a dynamic regulator of volume and solute exchange. Clinical and experimental pharmacology, & physiology. 27, 847-854 (2000).
- Rumbaut, R. E., Wang, J., Huxley, V. H. Differential effects of L-NAME on rat venular hydraulic conductivity. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. , 279-H2023 (2000).
- Yuan, D., He, P. Vascular remodeling alters adhesion protein and cytoskeleton reactions to inflammatory stimuli resulting in enhanced permeability increases in rat venules. Journal of applied physiology. 113, 1110-1120 (2012).
- Zhou, X., He, P. Temporal and spatial correlation of platelet-activating factor-induced increases in endothelial [Ca(2)(+)]i, nitric oxide, and gap formation in intact venules. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. 301, H1788-H1797 (2011).
- Adamson, R. H., et al. Oncotic pressures opposing filtration across non-fenestrated rat microvessels. The Journal of physiology. 557, 889-907 (2004).
- Adamson, R. H., et al. Epac/Rap1 pathway regulates microvascular hyperpermeability induced by PAF in rat mesentery. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. 294, H1188-H1196 (2008).
- Curry, F. E., Zeng, M., Adamson, R. H. Thrombin increases permeability only in venules exposed to inflammatory conditions. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. 294, H1188-H1196 (2003).
- Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nature. 32, 347-355 (2014).
- Bagher, P., Davis, M. J., Segal, S. S. Intravital macrozoom imaging and automated analysis of endothelial cell calcium signals coincident with arteriolar dilation in Cx40(BAC) -GCaMP2 transgenic mice. Microcirculation. 18, 331-338 (2011).
- Duza, T., Sarelius, I. H. Increase in endothelial cell Ca(2+) in response to mouse cremaster muscle contraction. The Journal of physiology. 555, 459-469 (2004).
- Oshiro, H., et al. L-type calcium channel blockers modulate the microvascular hyperpermeability induced by platelet-activating factor in vivo. Journal of vascular surgery. 22, 732-739 (1995).
- Chen, W., et al. Atrial natriuretic peptide-mediated inhibition of microcirculatory endothelial Ca2+ and permeability response to histamine involves cGMP-dependent protein kinase I and TRPC6 channels. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 33, 2121-2129 (2013).
- Harris, N. R., Whitt, S. P., Zilberberg, J., Alexander, J. S., Rumbaut, R. E. Extravascular transport of fluorescently labeled albumins in the rat mesentery. Microcirculation. 9, 177-187 (2002).
- Yuan, W., Li, G., Zeng, M., Fu, B. M. Modulation of the blood-brain barrier permeability by plasma glycoprotein orosomucoid. Microvascular research. 80, 148-157 (2010).
- Sugiura, Y., Morikawa, T., Takenouchi, T., Suematsu, M., Kajimura, M. Cilostazol strengthens the endothelial barrier of postcapillary venules from the rat mesentery in situ. Phlebology / Venous Forum of the Royal Society of Medicine. 29, 594-599 (2014).
- Guo, M., et al. Fibrinogen-gamma C-terminal fragments induce endothelial barrier dysfunction and microvascular leak via integrin-mediated and RhoA-dependent mechanism. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 29, 394-400 (2009).
- Dewar, A. M., Clark, R. A., Singer, A. J., Frame, M. D. Curcumin mediates both dilation and constriction of peripheral arterioles via adrenergic receptors. The Journal of investigative dermatology. 131, 1754-1760 (2011).
- Lee, J. F., et al. Balance of S1P1 and S1P2 signaling regulates peripheral microvascular permeability in rat cremaster muscle vasculature. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. 296, H33-H42 (2009).
- Landis, E. M. Microinjection studies of capillary permeability. II. The relation between capillary pressure and the rate at which fluid passes through the walls of single capillaries. Am J Physiol. 82, 217-238 (1927).
- Curry, F. E., Huxley, V. H., Sarelius, I. H., Linden, R. J. . Techniques in cardiovascular physiology Part 1. P3/1, 1-34 (1983).
- Vurek, G. G., Bennett, C. M., Jamison, R. L., Troy, J. L. An air-driven micropipette sharpener). J Appl Physiol. 22, 191-192 (1967).
- Curry, F. E., Clark, J. F., Adamson, R. H. Erythrocyte-derived sphingosine-1-phosphate stabilizes basal hydraulic conductivity and solute permeability in rat microvessels. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. 303, H825-H834 (2012).
- Bagher, P., Polo-Parada, L., Segal, S. S. Microiontophoresis and micromanipulation for intravital fluorescence imaging of the microcirculation. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2011).
- Adamson, R. H., et al. Attenuation by sphingosine-1-phosphate of rat microvessel acute permeability response to bradykinin is rapidly reversible. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. 302, H1929-H1935 (2012).
- Bates, D. O. Vascular endothelial growth factors and vascular permeability. Cardiovasc Res. 87, 262-271 (2010).
- Adamson, R. H., et al. Rho and rho kinase modulation of barrier properties: cultured endothelial cells and intact microvessels of rats and mice. The Journal of physiology. 539, 295-308 (2002).
- Curry, F. R., et al. Atrial natriuretic peptide modulation of albumin clearance and contrast agent permeability in mouse skeletal muscle and skin: role in regulation of plasma volume. The Journal of physiology. 588, 325-339 (2010).
- Neal, C. R., Bates, D. O. Measurement of hydraulic conductivity of single perfused Rana mesenteric microvessels between periods of controlled shear stress. The Journal of physiology. 543, 947-957 (2002).
- Adamson, R. H., et al. Albumin modulates S1P delivery from red blood cells in perfused microvessels: mechanism of the protein effect. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. 306, H1011-H1017 (2014).
- Huxley, V. H., Wang, J. J., Sarelius, I. H. Adaptation of coronary microvascular exchange in arterioles and venules to exercise training and a role for sex in determining permeability responses. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. 293, H1196-H1205 (2007).
- Huxley, V. H., Williams, D. A. Basal and adenosine-mediated protein flux from isolated coronary arterioles. Am J Physiol. 271, H1099-H1108 (1996).
- Davis, M. J., Gore, R. W. Double-barrel pipette system for microinjection. Am J Physiol. 253, H965-H967 (1987).
- Adamson, R. H., et al. Sphingosine-1-phosphate modulation of basal permeability and acute inflammatory responses in rat venular microvessels. Cardiovasc Res. 88, 344-351 (2010).
- Zeng, Y., Adamson, R. H., Curry, F. R., Tarbell, J. M. Sphingosine-1-phosphate protects endothelial glycocalyx by inhibiting syndecan-1 shedding. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. , H306-H363 (2014).
