Myocardial infarction (MI) is not only followed by impaired cardiac function but also by apoptosis in the amygdala, a brain region involved in the behavioral consequences of MI. This protocol describes how to induce MI, collect amygdala tissue and measure caspase-3 activity, a marker of apoptosis, therein.
Myokardinfarkt (MI) hat dramatische mittel- und langfristigen Auswirkungen auf die physiologischen und verhaltens Ebenen, aber die Mechanismen sind noch unklar. Unser Labor hat ein Rattenmodell der Post-MI-Syndrom, die eingeschränkter Herzfunktion, Verlust von Nervenzellen im limbischen System, kognitive Defizite und Verhaltens Anzeichen einer Depression zeigt entwickelt. Auf neuronaler Ebene, vermittelt Caspase-3-Aktivierung post-MI Apoptose in verschiedenen limbischen Regionen, wie der Amygdala – Spitzenwert von 3 Tagen nach der MI. Kognitiven und Verhaltensstörungen erscheinen 2-3 Wochen post-MI und diese korreliert statistisch mit Maßnahmen der Caspase-3-Aktivität. Das hier beschriebene Protokoll wird verwendet, um zu induzieren MI, sammeln Amygdala Gewebe und messen Caspase-3-Aktivität unter Verwendung Spektrofluorometrie. Um MI zu induzieren, wird der absteigenden Koronararterie für 40 Minuten verschlossen. Das Protokoll für die Auswertung der Caspase-3-Aktivierung beginnt 3 Tage nach MI: die Ratten getötet und die Amygdala isoliert rapiDLY aus dem Gehirn. Proben werden schnell in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -80 ° C gehalten, bis tatsächliche Analyse. Durchgeführt, um die Caspase-3-Aktivierung beurteilen Technik basiert auf der Spaltung eines Substrats (DEVD-AMC), die durch Caspase-3, die eine fluorogene Verbindung, die durch Spektrofluorometrie gemessen werden kann, freisetzt. Die Methodik ist quantitativ und reproduzierbar, aber die erforderliche Ausrüstung ist teuer und das Verfahren für die Quantifizierung der Proben ist zeitaufwendig. Diese Technik kann auf anderen Geweben, wie Herz und Niere verwendet werden. DEVD-AMC durch andere Substrate ersetzt werden, um die Aktivität von anderen Caspasen messen.
Caspasen oder Cystein-abhängigen Aspartat gerichtete Proteasen sind eine Familie von Enzymen, die in verschiedenen Homöostase processess 1 beteiligt sind. Caspasen können grob nach ihrer Rolle bei der Apoptose oder Entzündung eingestuft werden. Caspase-1, -4, -5 und -12 sind in eine Entzündung involviert während die in Apoptose eingreifen kann unterklassifiziert als Initiatorcaspasen (Caspase-8 und -9) und Vollstrecker Caspasen (Caspase-3, -6 und -7 ).
Caspasen spielen eine bedeutende Rolle in vielen Krankheiten, vor allem in Störungen, bei denen die Apoptose kann übermäßig sein, wie nach einem Myokardinfarkt (MI) oder zerebrale Ischämie beobachtet.
Im Rattenmodell der in unserem Labor verwendete post-MI-Syndrom festgestellt wird, dass Caspase-3 ist nicht nur im Myokard, sondern auch in 2 des limbischen Systems, die bei der Steuerung der Stimmung und Emotionen 3-6 gebracht wird aktiviert. Es ist auch ersichtlich, dass Caspase-3 ist in verschiedenen Regionen aktiviertendes limbischen Systems, wie der Amygdala und Hippocampus, und diese Aktivierung Gipfel rund 3 Tage nach dem ischämischen Insult 4. Interessant ist, dass Caspase-3-Aktivität korreliert mit post-MI Verhaltensstörungen, und dessen Dämpfung durch pharmakologische und ernährungsphysiologischen Interventionen reduziert diese Verletzungen, was auf eine mögliche Verbindung zwischen Caspase-3-und Post-MI Depressionen 7-12.
Caspase-3-Aktivierung kann nach verschiedenen Techniken gemessen werden. Westernblot ermittelt die enzymatischen Eigenschaften der Caspasen und aktive Enzyme sowie ihre pro-Enzymformen zu detektieren. Western-Blot, jedoch semi-quantitative und kleine Abweichungen können durch schwaches Signal-Rausch-Verhältnissen 13 verloren. Eine bessere Technik basiert auf der Spaltung eines Substrats (DEVD-AMC), die durch Caspase-3, die eine fluorogene Verbindung freigibt und spektrofluorometrisch gemessen werden kann. Caspase-3-Aktivierung ist ein zuverlässiger Marker für Apoptose. Die Messung der Apoptose can ist instabil, da das Zeitfenster für das Auftreten kurz ist, und der Nachbarzellen apoptotische Körper oder Zellen 14 phagozytieren können. Die Apoptose kann durch andere Techniken, wie Desoxyribonukleotidyltransferase dUTP nick end labeling (TUNEL) Test bestätigt werden, dass die DNA-Fragmentierung von apoptotischen Signalkaskaden 6, oder das Verhältnis der Pro- / anti-apoptotische Proteine wie Bax / resultierenden erkennt Bcl2 6.
Unsere Erfahrung mit diesem Protokoll in den letzten 10 Jahren zu der Ermittlung der kritischen methodische Probleme. Erstens ist eine schnelle Gehirn Dissektion in einer Petrischale auf zerstoßenem Eis wichtig, Vorbereitung Qualität aufrecht zu erhalten. Zweitens muss realisiert werden, dass Gewebe Beschallung kürzer für die zerebrale Amygdala Vergleich zu anderen Arten von Geweben, wie dem Herzen (10 sec) oder der Nieren (20 sec). Drittens sollte darauf geachtet, vermischen sorgfältig das Substrat, bevor Sie die Ware in den Proben werden. Wir stießen auf veränderliche Signale, wenn das Mischfolge war unzureichend. Viertens sollten keine Blasen in der Quarzzelle vorhanden sein, wenn das Lesen der Proben. Andernfalls könnte das Signal verändert werden.
Wir eine Änderung in den letzten Jahren, um die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse zu erhöhen: Erhöhung der Substrat Volumen zu Volumen von weniger als 1 & mgr; l zu vermeiden. Dennoch können kleine Veränderungen zwischen aufeinander Assays auftreten, und mindestens 3 Kontrollproben verwendet werdenSteuerung für Variationen. Fluoreszenz Maßnahmen dieser Steuerelemente werden gemittelt, und der Mittelwert wird als 100% gesetzt. Fluoreszenz Maßnahmen experimentellen Proben werden in Prozent der Kontrollproben umgewandelt.
Eine weitere Einschränkung des Verfahrens ist, dass nur ein Teil des Gewebes verwendet wird und daher die Caspase-3-Aktivität unterschätzt werden kann. Tatsächlich ist das Zeitfenster der Apoptose kurz in jede gegebene Zelle und kann verfehlt werden, obwohl es in den benachbarten Bereichen tritt zum Zeitpunkt der Probenahme 1,4,15. Das Umgekehrte ist ebenfalls möglich: Apoptose konnte in Gewebeteile besonders intensiv sein, was zu einer Überschätzung der Caspase-3-Aktivität. Wir empfehlen die Verwendung von Restgewebe (Amygdala) für komplementäre Techniken wie TUNEL-Assays oder Bax / Bcl-2-Verhältnis (siehe Einleitung).
Spektrofluorometrie weist wenigstens zwei Vorteile gegenüber der Western Blot. Erstens, direkt erzeugt quantitative Daten. Zweitens misst er eine enzymatischectivity selbst anstatt Protein oder RNA-Expression, die unabhängig sein können, und es ist bekannt, dass die Proteinexpression kann ohne jede Änderung in der enzymatischen Aktivität erhöht werden. Darüber hinaus kann Spektrofluorometrie auf andere Gewebe oder mit unterschiedlichen Tierarten durchgeführt werden, und kann für andere Caspase Subtypen eingestellt werden kann, mit verschiedenen Substraten, so dass sichere Vergleiche angestellt werden können.
Abschließend Dieses Dokument zeigt die Verwendung Spektrofluorometrie Caspase-3-Aktivität in der Amygdala zu messen, den Nachweis, dass die Apoptose tritt in diesem Bereich des limbischen Systems 3 Tage nach MI.
The authors have nothing to disclose.
. Diese Arbeit wurde unterstützt durch einen Zuschuss aus den Natur- und Ingenieurwissenschaften Research Council of Canada Kim Gilbert unterstützt hält ein Stipendium vom Fonds de la recherche du Québec – Santé.
Spectroflurometer | Photon technology Instrument (now Horiba) | Ratiomaster M-40 | with DeltaRAM Random Access Monochromator |
Respirator | Harvard apparatus | 683 | small animal ventilation |
Glass cuvette | NSG precision cells | 3G10 | Optical Glass (340-2,500nm) 10 mm path |
Sonicator | Cole Parmer | 4710 series | |
Spectrometer | Varian | Cary 50 Bio |