Matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) and molecular techniques (16S rRNA gene sequencing) permit the identification of rare bacterial pathogens in routine diagnostics. The goal of this protocol lies in the combination of both techniques which leads to more accurate and reliable data.
Özellikle bağışıklık sistemi baskılanmış hastalarda ciddi enfeksiyonlara neden bildirilmiştir nedenle, yetersiz tarif, nadir ve bakteriyel patojenler bir dizi vardır. Çoğunlukla olgu sunumları olarak yayınlanan çoğu durumda sadece birkaç veri, içinde, bir enfeksiyöz ajan gibi patojenlerin rolünü araştırmak hangi mevcuttur. Bu nedenle, bu tür mikroorganizmaların patojenik karakterini açıklamak için, bakterilerin büyük sayılardan epidemiyolojik çalışmalar yapmak gerekmektedir. suşlarının tanımlanması, bunlar rutin tanı, (sağlamlık) işlemek için kolay, ekonomik olmalıdır geçerli terminolojisine göre doğru olmalı ve onlar karşılaştırılabilir üretmek zorunda: Böyle bir sürveyans çalışmasında kullanılan yöntemler aşağıdaki kriterleri karşılamak için var laboratuvarlar arası sonuçları. Genellikle rutin bir ortamda bakteri suşları tanımlamak için üç strateji vardır: Bıochemıca karakterize 1) fenotipik tanımlamaBakterilerin l ve metabolik özellikleri, 2) bu tür yeni bir proteom göre bir yaklaşım olarak 16S rRNA gen dizilimi ve 3) kütle spektrometrisi gibi moleküler teknikler. kütle spektrometrisi ve moleküler yaklaşımların bakteriyel türlerinin büyük bir çeşitlilik belirlemek için en umut verici olduğu için, bu iki yöntem tarif edilmiştir. Bu teknikler kullanılarak Gelişmeler, sınırlamalar ve potansiyel problemler tartışılmıştır.
Rutin teşhis nadir patojenlerin güvenli kimlik klasik kültürel ve biyokimyasal yöntemler hantal ve bazen tartışmalı olduğu gerçeği ile engellenmektedir. Bundan başka, bir teşhis mikrobiyoloji laboratuar otomatik sistemlerin kullanılmasını gerektirir günlük olarak birkaç bin birkaç yüz kadar patojenlerin çok sayıda, işleme alır. Bir günlük yüksek verim yönetiminde ek olarak, bakteri türleri kesin tanımlanması gereklidir. Onların antibiyotik duyarlılık paterni farklı ve bu nedenle doğru tanımlama, uygun antibiyotik seçmek için gerekli bilgileri (örneğin, Enterococcus spp., Acinetobacter spp.) 12,43 ile klinisyene sağlar çünkü bu garanti edilir.
Otomatik mikrobiyal tanıma sistemleri (Amis) bakteriyel izolatların metabolik özelliklerini karakterize etmek için enzimatik reaksiyonların standart setleri uygulamak <sup> 13,15,16,26,27. Bu sistemlerde kullanılan kartuşlar farklı biyokimyasal reaksiyonların çok sayıda, örneğin, bu çalışmada 52 kullanılan Amis GN kartı 47, sadece bakterilerin sınırlı kümesi için bu strateji izin güvenli kimlik kullanmak rağmen. Ayrıca, veritabanı, gelişmiş bir uzman sistem, açıkça tıbbi önemi 13,15,16,36 ilgili ve son derece alakalı bakterilerin saptanması üzerine odaklanmıştır. yaygın laboratuarlarda kullanılan iki başka sistemler de bakteriyel tanımlama için biyokimyasal bir yaklaşım geçerlidir. Türler 35 level üzerinde 3. Amis sadece% 82.4 bir kimlik doğruluğunu sahipken Son çalışmalar, bu çalışmada kullanılan Amis ve rakiplerinden biri (% 93.7 ve sırasıyla% 93.0) arasında bir mukayese kimlik doğruluğunu göstermektedir. Bu tür farklılıklar altta yatan kimlik verileri referanslar, kitler ve yazılım METABO farklılıklar versiyonları kalitesi ile açıklanabilirtutumların ve teknik personel 35,36 yeterlilik.
İki otomatik -TOF MS sistemleri (-TOF mikrobik tanımlama sistemi, MMIS) çoğunlukla kullanılır. Bu sistemler, protein, parmak izi kütle spektrumları göre bakteri türlerinin çok sayıda tespiti için verir. Örneğin, kullanılan MMİS veritabanı 6000, referans spektrumları içerir. Kütle spektrometresi dayalı tanımlama sistemleri nadir patojenler 11,48,51 dahil mikroorganizmaların büyük bir çeşitlilik hızlı ve güvenilir şekilde algılanmasını sunuyoruz. Bugüne kadar sadece bir kaç doğrudan karşılaştırmalar bu çalışmada kullanılan MMIS ve rakiplerinin 19,33 arasında mevcuttur. Dæk göre ve ark., Her iki sistem de tanımlama doğruluğu benzer yüksek oranda sağlar, ancak bu çalışmada kullanılan MMİS türlerin belirlenmesi 19 daha güvenilir olduğu görülmektedir.
Benzer bir şekilde, moleküler teknikler de, aynı zamanda korunmuş ama adresleme ayrı genler ( <em> örneğin, 16S rDNA veya rpoB) berrak tür kimlik 3,22,61 izin verir. Bunlar arasında, 16S rDNA çünkü tüm bakteriler 34 varlığını en yaygın olarak kullanılan temizlik gendir. Bunun işlevi, biyo-bilişim 14,34 için müsait olması için yeterince uzun olan, yaklaşık 1500 bp ile değişmeden ve son olarak kalır. Birçok araştırmacı bakteri tanımlama 21 "altın standart" olarak 16S rRNA gen analizi görüyoruz. Bu az laboratuar az ya da yeni bakteri 14,34 tanımlanması için bugüne kadar DNA-DNA hibridizasyon teknikleri kullanmak olmasından kaynaklanmaktadır. Buna ek olarak, daha fazla veri tabanı 16S rRNA gen analizinde 50 için kullanılabilir temin edilebilmektedir. Bununla birlikte, 16S rDNA bazlı algılama sistemleri, standart PCR protokollerine göre sınırlı bir duyarlılığa sahip olduğu dikkate alınmalıdır. Dahası, moleküler yaklaşım zaman alıcı, sofistike ve yüksek eğitimli personel yanı sıra gerektirirözel laboratuvar olanakları ve, bu nedenle, kolayca rutin teşhis 55 içine uygulanmadı. Bundan başka, bakteri kimlik, en az iki farklı yöntem kombinasyonu son derece hassas soy tanımlanmasına neden olduğu gösterilmiştir. MALDI-TOF MS ile 16S rDNA sekanslama kombinasyonu, yüksek hassasiyetle farklı bakteri türlerinin çok sayıda tanımlanmasına izin verir. Son zamanlarda -TOF MS ve 16S rRNA gen analizinin kombinasyonu epidemiyolojik soruları ve nadir patojenler 56 okuyan bakteri tanımlama için sunuldu.
-TOF MS ve 16S rRNA gen sıralama Hem farklı bakteri çok sayıda tespit imkanı sunuyoruz. MALDI-TOF MS kolu ve bakteriyel kütle spektrumları büyük veri tabanları kullanılabilir kolay, hızlı ve ucuz bir yöntemdir. Bu nedenle, MALDI-TOF MS nadir bakteriyel patojenler 17,20,39,51 odaklanmış tarama çalışmaları yapmak için hızlı, uygun maliyetli ve güvenilir bir yöntemdir. Diğer fenotipik tanımlama yöntemleri, Seng ve ark. Göstermiştir maliyet etkinliği ve MALDI-TOF MS 59…
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to thank Prof. Enno Jacobs for his continuing support.
CHROMASOLV, HPLC grade water, 1 L | Sigma-Aldrich Chemie, München, Germany | 270733 | |
Tissue Lyser LT | Qiagen, Hilden, Germany | 85600 | Oscillating Homogenizer |
Glass-beads 1,0mm | VWR International, Darmstadt, Germany | 412-2917 | |
Thermomixer 5436 | Eppendorf, Hamburg, Germany | 2050-100-05 | |
QIAamp DNA Mini Kit (250) | Qiagen, Hilden, Germany | 51306 | |
Taq PCR Core Kit (1000 U) | Qiagen, Hilden, Germany | 201225 | |
Forward Primer TPU1 (5´-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3’) | biomers.net GmbH, Ulm, Germany | – | |
Reverse Primer RTU4 (5´-TAC CAG GGT ATC TAA TCC TGT T-3´) | biomers.net GmbH, Ulm, Germany | – | |
Mastercycler | Eppendorf, Hamburg, Germany | - | Thermocylcer |
Reaction tube 1.5 mL | SARSTEDT, Nümbrecht, Germany | 72,692 | |
Reaction tube 2 mL | SARSTEDT, Nümbrecht, Germany | 72,693,005 | |
PCR 8er-CapStrips | Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Germany | 711040X | |
PCR 8er-SoftStrips | Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Germany | 711030X | |
Sharp R-ZV11 | Sharp Electronics, Hamburg, Germany | – | Microwave |
Titriplex III (EDTA Na2-salt dehydrate; 1 kg) | Merck, Darmstadt, Germany | 1084211000 | |
SeaKem LE Agarose | Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Germany | 849006 | |
(2 x 500 g) | |||
SmartLadder SF – 100 to 1000 bp | Eurogentec, Lüttich, Belgium | MW-1800-04 | |
Bromphenol blue (25 g) | Sigma-Aldrich Chemie, München, Germany | B0126 | |
Xylene cyanol FF (10 g) | Sigma-Aldrich Chemie, München, Germany | X4126 | |
ComPhor L Maxi | Biozym, Hessisch Oldendorf, Germany | – | |
Ethidium bromide solution 1 %(10 mL) | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 2218.1 | |
Gel Doc 2000 | Bio-Rad Laboratories, München, Germany | – | Gel-documentation system |
ExoSAP-IT (500 reactions) | Affymetrix UK, Wooburn Green, High Wycombe, United Kingdom | 78201 | |
Buffer (10 x) with EDTA | Life Technologies, Darmstadt, Germany | 402824 | |
BigDye Terminator Kit v1.1 | Life Technologies, Darmstadt, Germany | 4337450 | |
Hi-Di formamide (25 mL) | Life Technologies, Darmstadt, Germany | 4311320 | |
DyeEx 2.0 Spin Kit (250) | Qiagen, Hilden, Germany | 63206 | |
3130 Genetic Analyzer | Life Technologies, Darmstadt, Germany | – | Sequenzer |
MicroAmp optical 96-well reaction plate with barcode | Life Technologies, Darmstadt, Germany | 4306737 | |
3130 Genetic Analyzer, plate base 96-well | Life Technologies, Darmstadt, Germany | 4317237 | |
3130 Genetic Analyzer, plate retainer 96-well | Life Technologies, Darmstadt, Germany | 4317241 | |
3130 Genetic Analyzer, well plate septa | Life Technologies, Darmstadt, Germany | 4315933 | |
3130 Genetic Analyzer, POP-7 Polymer, 7 mL | Life Technologies, Darmstadt, Germany | 4352759 | |
3130 Genetic Analyzer, 4-Capillary Array, 50 cm | Life Technologies, Darmstadt, Germany | 4333466 | |
Sequencing Analysis Software 5.4 | Life Technologies, Darmstadt, Germany | – | |
microflex (the MALDI TOF MS maschine) | Bruker Daltonik, Bremen, Germany | – | |
MALDI Biotyper (the MALDI TOF MS system) | Bruker Daltonik, Bremen, Germany | – | our mMIS |
VITEK MS | bioMérieux, Nürtingen, Germany | 2nd mMis | |
flexControl 3.4 (control software) | Bruker Daltonik, Bremen, Germany | – | |
Biotyper Realtime Classification 3.1 (RTC), (analysis software) | Bruker Daltonik, Bremen, Germany | – | |
α-cyano-4-hydroxycinnamic acid, HCCA, 1 g | Bruker Daltonik, Bremen, Germany | 201344 | |
Peptide Calibration Standard II | Bruker Daltonik, Bremen, Germany | 222570 | |
MSP 96 target polished steel | Bruker Daltonik, Bremen, Germany | 8224989 | |
peqgreen | peqlab | 37-5010 | |
MALDI Biotyper Galaxy | Bruker Daltonik, Bremen, Germany | Part No. 1836007 | |
Vitek 2 | bioMérieux, Nürtingen, Germany | our aMis | |
MicroScan | Beckman Coulter | 2nd aMis | |
BD Phoenix™ Automated Microbiology System | BD | 3rd aMis | |
Staphylococcus aureus subsp. aureus Rosenbach (ATCC® 25923™) | ATCC | postive control for PCR |