We report a reliable method to isolate and culture primary tumor-specific endothelial cells from genetically engineered mouse models.
תאי גידול ספציפי מבודדים טרי אנדותל (TEC) יכולים לשמש כדי לחקור מנגנונים מולקולריים של אנגיוגנזה גידול ולשמש כמודל במבחנה לפיתוח מעכבי אנגיוגנזה חדשים לטיפול בסרטן. עם זאת, לטווח ארוך בהרחבת מבחנה של תאי האנדותל עכברי (EC) הוא מאתגר עקב סחיפה פנוטיפי בתרבות (מעבר אנדותל לmesenchymal) וזיהום עם לא-אירופי. זה נכון במיוחד עבור TEC הoutcompeted בקלות על ידי fibroblasts-מטוהר שיתוף או תאים סרטניים בתרבות. הנה, שיטת בידוד איכות גבוהה שמנצלת העשרת immunomagnetic בשילוב עם מבחר מושבה ובהרחבת מבחנה מתוארת. גישה זו יוצרת שברי EC טהורים שהם חופשיים לחלוטין של זיהום תאי סטרומה או גידול. כמו כן הוא הראה שcre Cdh5-לייחס שושלת: העכברים / ליטר ZsGreen s / l כתב, בשימוש עם הפרוטוקול מתואר במסמך זה, הינו כלי רב ערך כדי לוודא תאטוהר כמושבות EC המבודדות מעכברים אלה מראה הקרינה ZsGreen עמידה ומבריקה בתרבות.
תאי האנדותל (EC) הם חיוניים במהלך הפיתוח של גידולים מוצקים. מייזום מתג angiogenic בגידולים רדומים להפצה וזריעה של גרורות באתרים מרוחקים, EC ליצור צינורות המספקים דם, חמצן וחומרים מזינים כדי לקיים את צמיחת גידול 1. כפי שהוצע לאחרונה, EC יש גם פונקציות זלוף-עצמאי ויוצר נישה שתומכת בצמיחה של תאי גזע סרטני ותאי סטרומה גידול אחרים 2-5. לפיכך, מטוהר ביותר גידול ספציפי EC (TEC) לתרבות במבחנה מאפשר ללימודים תפקודיים שיגרתי שישפוך אור על מנגנונים מולקולריים רומן תיווך אנגיוגנזה גידול ולדבר לחצות עם תאים סרטניים.
EC הם מאוד מיוחדים בהתאם לרקמת המוצא 6. בשל האופי הטרוגני סוגים שונים של גידול ומייקרו-הסביבה של הגידול, TEC יכול גם להציג תכונות ייחודיות המשקפות את גידול o התמחות ספציפיו בכלי הדם. לדוגמא, יש שונות בולטות בחתימות ביטוי גנים בTEC מבודדות מסוגים או ציונים של גידולי 7,8 שונים. עם זאת, שיתוף טיהור תכופה של אי-EC, במיוחד fibroblasts הקשורים גידול ותאים סרטניים, עם TEC יכולה לבלבל ביטוי הגנום מנתח. סוגי התאים לא רצויים אלה הם בעייתיים במיוחד במחקרים המסתמכים על טווח ארוך בהרחבת מבחנה של תרבויות TEC.
שתואר כאן היא שיטה באיכות גבוהה שמייצרת באופן עקבי תרבויות EC טהורות מגידולים ורקמות אחרות. בעקבות העשרת עמודת immunomagnetic של שברים EC והסרת מטוהר שיתוף הלא-EC, צעד שיבוט-טבעת נוספת כדי ללכוד מושבות EC טהורות משמשת 9. כל מושבה ניתן להרחיב בתרבות לקטעים מרובים ללא ההופעה של זיהום שאינו EC. שיטה זו גם תשואות שיבוטים EC מרובים מהליך בידוד יחיד, שהוא אידיאלי ללימוד אנדוההטרוגניות thelial. בנוסף, הוא הראה כי cre Cdh5: עכברי הכתב / L / L ZsGreen שלהם כלי רב ערך ליצירת EC "ממופה גורל" ובל יימחו-מסומן אשר לשמור על הקרינה ZsGreen בתרבות 10. עם התאמות קלות לפרוטוקול, שיטה זו צריכה להיות להתאמה לסוגי גידולים שונים או רקמות נורמליות.
בשל הקשיים בהשגת תרבויות TEC העיקרי טהורות, רב במחקרי מבחנה TEC תחליף עם קווים זמינים מסחרי EC או EC העיקרי כגון וריד טבור האנושי EC (HUVEC) 13. עם זאת, אוכלוסיות אלה EC מרקמות נורמליות יכולות רק לשמש כמדד לTEC אשר נבדלים במידה ניכרת מעמיתיהם הרגילים. לדוגמא, TEC הם phenotypicall…
The authors have nothing to disclose.
ACD is supported by a grant from the National Institute of Health (R01-CA177875). LX is a fellow in the HHMI-funded translational medicine program at UNC Chapel Hill. JVM is supported by a T32 pre-doctoral fellowship from the Integrative Vascular Biology Program at UNC Chapel Hill. We thank Clayton Davis for assistance with confocal microscopy.
Antibiotic-Antimycotic | Sigma-Aldrich | A5955 | |
Dulbecco's Modified Eagle's medium (1 g/L D-glucose) (LG-DMEM) | Gibco | 11885-084 | |
EGM-2 Bullet Kit | Lonza | CC4176 | Not all components used |
Fetal bovine serum (Hyclone) | Thermo Scientific | SH30071.03 | Heat inactivated at 56°C for 30 min |
Nu-Serum IV | Corning | CB-51004 | |
Hank's Balanced Salt Solution (HBBS) | Gibco | 14175-095 | |
Phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 14190-144 | |
FACS buffer | – | – | 0.5 % BSA and 2 mM EDTA in PBS, filtered through a 0.22 μm filter |
75% v/v ethanol for disinfection | – | – | |
Anti-PE microbeads | Miltenyi Biotech | 130-048-801 | |
Bovine serum albumin (BSA) fraction V, 7.5% | Gibco | 15260-37 | |
Cell freezing media (Bambanker) | Wako Chemicals | 302-14681 | |
Collagenase type II | Worthington Biochemical | LS004176 | Make stock concentration 2 mg/ml in HBSS |
Deoxyribonuclease I (DNase) | Worthington Biochemical | LS002004 | Make stock concentration 1 mg/mL in PBS |
Dil-Ac-LDL | Biomedical Technologies | BT-902 | |
EDTA, 0.5M, pH 8.0 | Cellgro | 46-034-CL | |
Enzymatic cell detachment solution (Accutase) | Sigma-Aldrich | A6964-100ML | |
Gelatin, 2 % in water, tissue culture grade | Sigma-Aldrich | G1393-100ML | Dilute in PBS to make 0.5 % gelatin solution |
Mouse FcR Blocking Reagent | Miltenyi Biotech | 130-092-575 | |
Neutral protease (Dispase) | Worthington Biochemical | LS02104 | Make stock concentration 2.5 U/mL in HBSS |
PE-rat anti-mouse CD31 antibody | BD Pharmingen | 553373 | |
RBC lysis buffer (BD Pharm Lyse) | BD Pharmingen | 555899 | |
Sterile water | – | – | |
Trypan blue, 0.4 % | Life Technologies | 15250-061 | |
10 mm tissue culture dishes | Corning | – | |
15 mL conical tubes (sterile) | Corning | – | |
50 mL conical tubes (sterile) | Corning | – | |
6-well tissue culture plates | Corning | – | |
Tissue-dissociator tubes (gentleMACS) C tubes) | Miltenyi Biotech | 130-093-237 | |
Cell Separator (MidiMACS) | Miltenyi Biotech | 130-042-302 | |
Cell strainer 100 μm | Corning | 352360 | |
Cloning rings (assorted sizes) | Bel-Art Products | 378470000 | |
Cryotubes | Thermo Scientific | – | |
Dissecting board | – | – | Sterilize or disinfect with 75% v/v ethanol before use |
Dissecting forceps and scissors | – | – | Sterilize before use |
Dissecting pins 2" | – | – | Sterilize before use |
FACS tubes with 35 μm filter cap | Corning | 352235 | |
Filter cup (Stericup, 0.22 μm) | Millipore | SCGPU05RE | |
Fine-tip marker | – | – | |
Hemocytometer | – | – | |
LS Columns | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | |
Magnetic Multistand | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
Tissue adhesive (Vetbond) | 3M | 1469SB | |
Centrifuge | Eppendorf | 5810R | Or a centrifuge with similar capacity for 15 mL and 50 mL conical tube centrifugation |
Tissue culture hood | – | – | |
Tissue dissociator (gentleMACS) | Miltenyi Biotech | 130-093-235 | Preset program "m_impTumor_01" used for tissue dissociation |
Liquid nitrogen freezer | – | – | |
Microplate or rotary shaker | – | – | |
Phase contrast light microscope | – | – |