A depleção seletiva de Microglia de Cerebelar Granule culturas de células utilizando L-leucina éster metílico

Summary

Microglia can influence neurons and other glia in culture by various non-cell autonomous mechanisms. Here, we present a protocol to selectively deplete microglia from primary neuronal cultures. This method has the potential to elucidate the role of microglial-neuronal interactions, with implications for neurodegenerative conditions where neuroinflammation is a hallmark feature.

Abstract

Microglia, the resident immunocompetent cells of the CNS, play multifaceted roles in modulating and controlling neuronal function, as well as mediating innate immunity. Primary rodent cell culture models have greatly advanced our understanding of neuronal-glial interactions, but only recently have methods to specifically eliminate microglia from mixed cultures been utilized. One such technique – described here – is the use of L-leucine methyl ester, a lysomotropic agent that is internalized by macrophages and microglia, wherein it causes lysosomal disruption and subsequent apoptosis^13,14. Experiments using L-leucine methyl ester have the power to identify the contribution of microglia to the surrounding cellular environment under diverse culture conditions. Using a protocol optimized in our laboratory, we describe how to eliminate microglia from P5 rodent cerebellar granule cell culture. This approach allows one to assess the relative impact of microglia on experimental data, as well as determine whether microglia are playing a neuroprotective or neurotoxic role in culture models of neurological conditions, such as stroke, Alzheimer’s or Parkinson’s disease.

Introduction

O cérebro humano compreende um número estimado de 85 mil milhões de neurónios e mais 85 mil milhões de células não neuronais, incluindo as células da glia ^1. Para a maior parte dos últimos 100 anos os neurocientistas têm focado predominantemente na população de células neuronais, acreditando células gliais ser pouco mais do que as células passivas de apoio que forneceram suporte estrutural para os neurônios – daí a etimologia grega da "glia" traduzido para o Inglês como "cola". Recentemente, no entanto, tornou-se cada vez mais evidente que as interacções neuronais-glial pode ser muito mais fundamental para aspectos básicos da neurobiologia, neurofisiologia, ea gênese e progressão de várias doenças neurodegenerativas. Células do cerebelo granulares (CTC), a população neuronal homogênea mais abundante no cérebro humano, dominar o cerebelo e tornar-se mais de 90% dos seus constituintes celulares. Por conseguinte, estas células têm sido extensivamente usados ​​in vitro, como um sistema modelo para o tele estudo do desenvolvimento neuronal, função e patologia ^2-6.

No entanto, as culturas CGC ainda conter outros microglia e as células da glia em proporções significativas, sem dúvida. Como resultado, os dados que indicam CGC putativamente respostas neuronais directos para tratamentos diferentes de células podem, de facto surgir – em parte ou no total, – a partir da resposta secundária indirecta de células gliais vizinho na cultura. Para avaliar isto, eliminada selectivamente da microglia CGC de culturas neuronais, com o auxílio de éster metílico de L-leucina (LME). LME é um agente lysomotropic originalmente usado para destruir selectivamente macrófagos ^7, e uma vez que tem sido utilizada para esgotar a microglia também selectivamente a partir neural, astrócitos, e culturas gliais mistas ^8,9,10. LME é internalizado pelos macrófagos e microglia, em que ele provoca perturbações lisossômico e apoptose subseqüente ^13,14. Macrófagos e microglia são caracteristicamente rica em lisossomos, fazendo com que sejam particularly vulnerável após a exposição ao tratamento LME. Este protocolo fornece uma maneira poderosa, mas simples e fácil de determinar a contribuição de microglia em experimentos que utilizam outros sistemas de cultura neuronal / CGC e gliais.

Protocol

Todos os experimentos aqui descritos foram realizados de acordo com o Reino Unido Animais (Scientific Procedures) Act, de 1986. 1. Preparação de Instrumentos, Meios de Cultura, e pratos Prepare duas tesouras de aço inoxidável laboratório de dissecação e duas pinças de laboratório de aço inoxidável. Autoclave todos os instrumentos e lugar em uma capa de cultura O / N sob luz ultravioleta (UV) para a esterilização. Adicione 500 ml de meio essencial (MEM), meio…

Representative Results

A capacidade desta técnica para eliminar selectivamente a partir CGC microglia e / ou culturas mistas baseia-se na capacidade subsequente do investigador para identificar com precisão e diferenciar microglia das suas células vizinhas. Isto pode ser alcançado utilizando uma máquina de células específicas de microglia, tais como isolectina-B4, tal como ilustrado na Figura 1. Tal como demonstrado na Figura 2, não há alterações observáveis ​​para astrócitos e densidade neur…

Discussion

Os passos mais importantes para garantir a eliminação seletiva de sucesso de microglia do CGC e / ou culturas mistas são: 1) a manutenção de uma cultura CGC estéril e saudável; 2) filtro de esterilização a forma LME contendo e voltando a solução para pH 7,4; 3) manter os meios de comunicação CGC retidos e LME contendo media a 37 ° C para evitar choque térmico; e 4) a trabalhar rapidamente para reduzir o tempo de células são mantidas fora da incubadora.

Utilizou-…

Materials

Forceps	Sigma-Aldrich	F4142	The curved end facilitates removal of the cerebellum
Micro-dissecting scissors	Sigma-Aldrich	S3146	Straight, sharp point facilitates rodent P4-7 dissection
L-leucine methyl ester hydrochloride	Sigma-Aldrich	7517-19-3
EBSS solution	Sigma-Aldrich	E7510-500 ml
Poly-D-lysine	Sigma-Aldrich	27964-99-4	Coat coverslips 1 day before use
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A9418
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma-Aldrich	P4417
DNase	Sigma-Aldrich	D5025
Soybean trypsin inhibitor	Sigma-Aldrich	T6414
Mouse anti-ED1 antibody	Abcam	ab31630