Hier wird ein Protokoll vorgestellt, um Bakterienerfassung durch CD4 + T-Zellen, die während der Antigenpräsentation über transinfection aus bereits infizierten dendritischen Zellen (DC) auftritt, zu messen. Wir zeigen, wie man die notwendigen Schritte durchführen: Isolierung von primären Zellen, Infektion von DC, DC / T-Zell-Konjugat-Bildung, und die Messung der bakteriellen T-Zell-Transfektion.
Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic cells (DCs) by a process called transinfection. Here, we describe the analysis of the transinfection process, which occurs during the course of antigen presentation. This process was unveiled by using CD4+ T cells from transgenic OTII mice, which bear a T cell receptor (TCR) specific for a peptide of ovoalbumin (OVAp), which therefore can form stable immune complexes with infected dendritic cells loaded with this specific OVAp. The dynamics of green fluorescent protein (GFP)-expressing bacteria during DC-T cell transmission can be monitored by live-cell imaging and the quantification of bacterial transinfection can be performed by flow cytometry. In addition, transinfection can be quantified by a more sensitive method based in the use of gentamicin, a non-permeable aminoglycoside antibiotic killing extracellular bacteria but not intracellular ones. This classical method has been used previously in microbiology to study the efficiency of bacterial infections. We hereby explain the protocol of the complete process, from the isolation of the primary cells to the quantification of transinfection.
Wenn ein Erreger infiziert seinen Wirt, gibt es normalerweise eine Aktivierung der angeborenen und adaptiven Immunreaktionen, für die bakterielle Clearance erforderlich. Angeborene Immunität ist die erste Verteidigungslinie, die meisten Infektionen verhindert. Angeborenen Immunität zu unterscheiden in einer präzisen Art und Weise Elemente, die in breiten Gruppen von Mikroorganismen konserviert sind (pathogen-associated molecular patterns, PAMPS) 1. Die Mechanismen der angeborenen Immunität umfassen physikalische Barrieren, wie Haut, Chemikalien Barrieren (antimikrobielle Peptide, Lysozym) und die angeborenen Leukozyten, der die Phagozyten (Makrophagen, Neutrophile, und dendritische Zellen), Mastzellen, Eosinophile, Basophile und natürliche Killerzellen umfassen 2. Diese Zellen identifizieren und zu beseitigen Krankheitserreger, entweder durch einen Angriff auf sie durch den Kontakt oder über die Phagozytose, die Erreger engulfing und Tötung umfasst. Dieses System erlaubt keine lebenslange Verteidigung, im Gegensatz zum adaptiven Immunität, die immunologisches Gedächtnis gegen p zu verleihenathogens. Die adaptiven Immunsystems ist die zweite Linie der Verteidigung und in der Lage zu erkennen und zu reagieren, um spezifische Antigene von mehreren mikrobiellen und nicht-mikrobielle Substanzen 3. Die Hauptkomponenten des adaptiven Immunsystems sind die Lymphozyten, die B und T-Zellen enthalten. B-Zellen werden in der humoralen Antwort beteiligt sind, die Antikörper gegen Pathogene oder exogenen Proteinen. Jedoch T-Zellen stellen die zellvermittelte Immunität, die Modulation der Immunantwort mit Cytokinen Sekretion oder Tötung pathogen-infizierten Zellen 4.
Antigen-präsentierende Zellen (APCs), die dendritischen Zellen oder Makrophagen, Bestandteile des angeborenen Immunsystems kann phagozytieren Pathogene und Prozess bakteriellen Komponenten in Antigene, die an der Zelloberfläche durch den Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) präsentiert werden 5-7 erkennt. Nach APCs haben Krankheitserreger phagozytiert, sie in der Regel zu den Lymphknoten, wo sie mit T interagieren migrierenZellen. T Lymphozyten spezifischen Peptid-MHC-Komplexe mit ihren T-Zell-Rezeptoren erkennen. Die Immun Synapse (IS) geschieht in der Grenzfläche zwischen einem Antigen-beladenen APC und einem Lymphozyten während der Antigenpräsentation 8,9. Einige Bakterien können Phagozytose überleben und systematisch zu verbreiten innerhalb von APCs. In dieser Ansicht dienen infizierte APCs als bakterielle Reservoirs oder "Trojanische Pferde", die bakterielle Ausbreitung 10 zu erleichtern. Der innige Kontakt zwischen APCs und Lymphozyten, die im Laufe des IS Bildung stattfinden, ebenfalls als Plattform für den Austausch eines Teils der Membranen, genetisches Material und Exosomen und kann für einige Viren, um T-Zellen zu infizieren missbraucht werden; Dieser Vorgang wird als transinfection 11-13.
Einige pathogene Bakterien (Listeria monocytogenes, Salmonella enterica und Shigella flexneri) sind in der Lage, T-Lymphozyten in vivo überfallen und ihr Verhalten 14-16 modifizieren. Wir habenkürzlich beschrieben, dass T-Lymphozyten können auch Bakterien durch transinfection von zuvor infizierten dendritischen Zellen (DCs) im Verlauf der Antigen-Präsentation 16 zu erfassen. T-Zell-bakterielle Gefangennahme durch transinfection überaus effektiver (1,000-4,000x) als direkte Infektionen. T-Zellen-Capture pathogen und nicht-pathogene Bakterien anzeigt als transinfection ist ein Prozess, durch T-Zellen angetrieben. Auffallend ist, transinfected T (TIT) Zellen rasch getötet die aufgenommenen Bakterien und tat dies effizienter als professionelle Phagozyten 16. Diese Ergebnisse, die ein Dogma der Immunologie zu brechen, zu zeigen, dass die Zellen der adaptiven Immunität Funktionen, die vermeintlich exklusive der angeborenen Immunität waren durchführen können. Darüber hinaus haben wir gezeigt, dass Zellen sezer TIT große Mengen von pro-inflammatorischen Zytokinen und zum Schutz vor bakteriellen Infektionen in vivo.
Hier die verschiedenen Protokolle verwendet, um die bakterielle transinfection Prozess studieren präsentieren wirein Mausmodell. Dieses Modell basiert auf der Verwendung von CD4 + T-Zellen von transgenen OTII Mäusen, die einen TCR spezifisch für Peptid 323-339 von OVA (OVAp) im Kontext mit I-Ak 17, die spezifisch mit bakteriell-infizierten Knochen in Wechselwirkung zu tragen basierend marrow- abgeleiteten DCs (BMDCs) 18,19 mit OVAp geladen, Bildung stabiler Immun Synapsen.
T-Zell-transinfection visualisiert werden können und verfolgt mittels Fluoreszenzmikroskopie. Zusätzlich Durchflusszytometrie zur Detektion infizierten Zellen unter Ausnutzung der Fluoreszenz durch Bakterien grün fluoreszierende Protein (GFP) exprimieren, 16,20 emittiert werden. Darüber hinaus können T-Zell transinfection durch eine empfindlichere Ansatz, der Gentamicin-Überlebenstests, die Messung einer großen Anzahl von Ereignissen kann quantifiziert werden. Gentamicin ist ein Antibiotikum, das nicht eukaryotischen Zellen eindringen kann. Daher ist die Verwendung dieses Antibiotikums erlaubt die Unterscheidung von intrazellulären Bakterien, die das Antibiotikum Zusätzlich fr lebtenom extrazellulären diejenigen, die getötet wurden 21.
T-Zellen oder T-Lymphozyten sind eine Art von Leukozyten, die eine zentrale Rolle bei der zellvermittelten Immunität spielen und gehören zu der adaptiven Immunantwort 26. T-Zellen sind resistent gegen in vitro infiziert aber einige Berichte zeigen, dass sie in vivo 14,15 infiziert werden. Die intime Kontakte des APC und T-Zellen während der Immunsynapse als Plattform für den Austausch von biologischem Material 13, darunter auch einige Viren wie HIV 11 …
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by grants BFU2011-29450, BFU2008-04342/BMC from the Spanish Ministry of Science and Innovation and PIES201020I046 from Consejo Superior de Investigaciones Cientìficas (CSIC).
RPMI | Fisher Scientific | SH3025501 | |
r-GMCSF | Peprotech | 315-03 | |
LPS | SIGMA | L2630-10mg | |
Na Pyruvate | Thermo Scientific | SH3023901 | |
2-ME | Gibco | 31350-010 | |
OVAp OTII (323–339) | GenScript | — | |
Cell Strainer 70uM | BD | 352350 | |
30uM Syringe Filcons Sterile | BD | 340598 | |
AutoMacs Classic | Miltenyi Biotec | 130-088-887 | |
Gentamicin | Normon | 624601.6 | |
Transwell | Costar | 3415 | |
LB | Pronadisa | 1231 | |
Agar | Pronadisa | 1800 | |
Paraformaldehyde 16% | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
Triton X-100 | |||
CD8 biot | BD Biosciences | 553029 | |
IgM Biot | ImmunoStep | Clone RMM-1 | |
B220 Biot | BD Biosciences | 553086 | |
CD19 biot | BD Biosciences | 553784 | |
MHC-II Biot (I-A/I-E) | BD Biosciences | 553622 | |
CD11b biot | Immunostep | 11BB-01mg | |
CD11c biot | Immunostep | 11CB3-01mg | |
DX5 biot | BD Biosciences | 553856 | |
Gr-1 biot | BD Biosciences | 553125 | |
CD16/CD32 | ImmunoStep | M16PU-05MG | |
anti Salmonella | ABD Serotec | 8209-4006 | |
CD11cPE | BD Biosciences | 553802 | |
CD4-APC | Tonbo Biosciences | 20-0041-U100 | |
Gr-1 APC | BD Biosciences | 553129 | |
MHC-II (I-A/I-E) FITC | BD Biosciences | 553623 | |
Alexa-Fluor 647 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody, highly cross-adsorbed | Invitrogen | A-21245 | |
CMAC (7-amino-4-chloromethylcoumarin) | Life technologies | C2110 | |
BSA | SIGMA | A7030-100G | |
Streptavidin MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-048-101 | |
BD FACSCanto II | BD Biosciences | — |