Induktion und Beurteilung der Ischämie-Reperfusion Injury in Langendorff-perfundierten Rattenherzen
Summary
The isolated rat heart is an enduring model for ischemia reperfusion injury. Here, we describe the process of harvesting the beating heart from a rat via in situ aortic cannulation, Langendorff perfusion of the heart, simulated ischemia-reperfusion injury, and infarct staining to confirm the extent of ischemic insult.
Abstract
The biochemical events surrounding ischemia reperfusion injury in the acute setting are of great importance to furthering novel treatment options for myocardial infarction and cardiac complications of thoracic surgery. The ability of certain drugs to precondition the myocardium against ischemia reperfusion injury has led to multiple clinical trials, with little success. The isolated heart model allows acute observation of the functional effects of ischemia reperfusion injury in real time, including the effects of various pharmacological interventions administered at any time-point before or within the ischemia-reperfusion injury window. Since brief periods of ischemia can precondition the heart against ischemic injury, in situ aortic cannulation is performed to allow for functional assessment of non-preconditioned myocardium. A saline filled balloon is placed into the left ventricle to allow for real-time measurement of pressure generation. Ischemic injury is simulated by the cessation of perfusion buffer flow, followed by reperfusion. The duration of both ischemia and reperfusion can be modulated to examine biochemical events at any given time-point. Although the Langendorff isolated heart model does not allow for the consideration of systemic events affecting ischemia and reperfusion, it is an excellent model for the examination of acute functional and biochemical events within the window of ischemia reperfusion injury as well as the effect of pharmacological intervention on cardiac pre- and postconditioning. The goal of this protocol is to demonstrate how to perform in situ aortic cannulation and heart excision followed by ischemia/reperfusion injury in the Langendorff model.
Introduction
Aufklärung der Ereignisse des Herz Reaktion auf sowohl Ischämie und Reperfusion zugrunde liegen weiter zu verbessern die Behandlung von Herzinfarkt und Herz 1 operative Eingriffe, die Aorten-Querspann 2 erfordern. Während in vivo Modellen von Ischämie-Reperfusionsverletzung ermöglichen sehr nützlich Endpunktanalyse, sind sie nicht so wirksam für die Untersuchung der funktionellen Auswirkungen von Ischämie-Reperfusionsverletzung akut in Echtzeit. Zusätzlich kann in vivo Ischämie-Reperfusion-Modelle erzeugen im Allgemeinen zu signifikanten Schwankungen in der Infarktgröße und die direkte Abgabe von Arzneimittel an das Herz zum Zeitpunkt der Reperfusion ist eine Herausforderung. Die Verwendung einer Langendorff-Herzen isoliert System für die Untersuchung ischämischen Reperfusionsschäden ermöglicht Echtzeit-funktionelle Bewertung der pharmakologischen Behandlungen, gleichmäßige Flächen infarzierten Gewebe und momentane Abgabe von Arzneimittel direkt in den Herzmuskel.
Zuerst beschrieben by Oscar Langendorff 1895 3 ist der Langendorff-Herz isoliert ein robustes Modell für die Untersuchung ischämischen Reperfusionsschäden, nachdem er in Ischämie-Reperfusion Forschung für den letzten 40 Jahren 4,5 verwendet. Hier werden einige Modifikationen vorgenommen, um das isolierte Herz zur Funktionsanalyse zu optimieren. In situ Kanülierung der Aorta, während das Herz schlägt, wird sichergestellt, dass das Herz nicht ischämischen Präkonditionierung, die die Ergebnisse der Ischämie-Reperfusion den Versuchen 6 verändern würden auftreten. Um dies zu erleichtern, wird ein Luftröhrenschnitt durchgeführt, so dass Belüftung und gewährleisten physiologische Stabilität der Ratte während der Operation. Das Herz wird dann auf eine Glaswassermantel spiral Säule, durch die Krebs-Henseleit-Puffer wird durch retrograde Perfusion direkt in die Aorta geliefert befestigt. Eine Kochsalzlösung gefüllten Ballon wird in den linken Ventrikel eingeführt und mit einem Druckwandler, der für die Echtzeit-Messung von Drücken von innerhalb der Herzkammer ein ermöglicht befestigtd Berechnung mehrerer funktioneller Parameter. Am Ende des Experiments wird das Herz mit kalter Kochsalzlösung gespült, um die Kontraktion und in flüssigem Stickstoff eingefroren, um Downstream-Analyse von DNA, RNA und Protein-Ebene ermöglichen verhaften. So modifizierte, dient der Langendorff-perfundierten Herzen als ein wirksames System für die direkte Überwachung der physiologischen Wirkung von pharmakologische Interventionen zu jeder Zeit während des akut ischämischen Reperfusionsschäden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Isoliert perfundierten Rattenherzen erfolgreich eingesetzt werden kann, um die Wirkung von pharmakologischen Intervention Herz Präkonditionierung Reperfusionsverletzung 9 untersuchen. Es gibt jedoch einige wesentliche Schritte der Prozedur, die um reproduzierbare Ergebnisse zu gewährleisten standardisiert werden müssen. Aufrechterhalten einer Temperatur von 37,4 ° C innerhalb des Systems ist entscheidend, denn auch milder Hypothermie und Hyperthermie kann Herz Präkonditionierung 10,11 führen….
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Veröffentlichung wurde von der South Carolina Clinical & Translational Research (SCTR) Institute unterstützt, mit einem akademischen Heimat an der Medizinischen Universität von South Carolina, NIH / NCATS Statt Anzahl UL1 TR000062. Weitere Unterstützung wurde von VA Merit Award BX002327-01 DRM zur Verfügung gestellt. DJH wurde von NIH / NCATS Statt Anzahl TL1 TR000061 von NIH Zuschusses Anzahl T32 GM008716 unterstützt. SEA wurde vom NIH Zuschusses Anzahl T32 HL07260 unterstützt.
Materials
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich | S3014 | |
| Potassium Chloride | Sigma Aldrich | P9541 | |
| Magnesium Sulfate | Sigma Aldrich | 203726 | |
| Potassium Phosphate Dibasic | Sigma Aldrich | RES20765-A7 | |
| Calcium Chloride Dihydrate | Sigma Aldrich | C8106 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | S5761 | |
| D-Glucose | Sigma Aldrich | G8270 | |
| Octanoic Acid | Sigma Aldrich | C2875 | |
| 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride | Sigma Aldrich | T8877 | |
| Medical Pressure Transducer | MEMSCAP | SP844 | |
| Masterflex Peristaltic Pump | Cole Parmer | EW-07521-40 | |
| Masterflex Easy Load Pump Head | Cole Parmer | EW-07518-10 | |
| Heated circulating water bath | Lauda | M3 | |
| Tubing Flow Module | Transonic | TS410 | |
| Modular Research Console | Transonic | T402 | |
| Inline flow sensor | Transonic | ME2PXN | |
| PowerLab Data Acquisition Device | AD Instruments | PL3508 | |
| LabChart data acquisition software | AD Instruments | MLU60/8 |
References
- Bainey, K. R., Armstrong, P. W. Clinical perspectives on reperfusion injury in acute myocardial infarction. American Heart Journal. 167 (5), 637-645 (2014).
- Beyersdorf, F. The use of controlled reperfusion strategies in cardiac surgery to minimize ischaemia/reperfusion damage. Cardiovascular Research. 83 (2), 262-268 (2009).
- Langendorff, O. Untersuchugen am überlebenden Säugethierherzen. Pflügers Archives. 61, 291-307 (1895).
- Bell, R. M., Mocanu, M. M., Yellon, D. M. Retrograde heart perfusion: The langendorff technique of isolated heart perfusion. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 50 (6), 940-950 (2011).
- Tyers, G. F., Todd, G. J., Neely, J. R., Waldhausen, J. A. The mechanism of myocardial protection from ischemic arrest by intracoronary tetrodotoxin administration. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 69 (2), 190-195 (1975).
- Murry, C. E., Jennings, R. B., Reimer, K. A. Preconditioning with ischemia: A delay of lethal cell injury in ischemic myocardium. Circulation. 74 (5), 1124-1136 (1986).
- Kolwicz, S. C., Tian, R. Assessment of cardiac function and energetics in isolated mouse hearts using 31P NMR spectroscopy. The Journal of Visualized Experiments. (42), (2010).
- Fishbein, M. C., et al. Early phase acute myocardial infarct size quantification: Validation of the triphenyl tetrazolium chloride tissue enzyme staining technique. American Heart Journal. 101 (5), 593-600 (1981).
- Aune, S. E., Herr, D. J., Mani, S. K., Menick, D. R. Selective inhibition of class I but not class IIb histone deacetylases exerts cardiac protection from ischemia reperfusion. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 72, 138-145 (2014).
- Yellon, D. M., et al. The protective role of heat stress in the ischaemic and reperfused rabbit myocardium. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 24 (8), 895-907 (1992).
- Khaliulin, I., et al. Temperature preconditioning of isolated rat hearts–a potent cardioprotective mechanism involving a reduction in oxidative stress and inhibition of the mitochondrial permeability transition pore. The Journal of Physiology. 581 (Pt 3), 1147-1161 (2007).
- Molojavyi, A., et al. Effects of ketamine and its isomers on ischemic preconditioning in the isolated rat heart). Anesthesiology. 94 (4), 623-629 (2001).
- Asfour, H., et al. NADH fluorescence imaging of isolated biventricular working rabbit hearts. The Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
- Sill, B., Hammer, P. E., Cowan, D. B. Optical mapping of langendorff-perfused rat hearts. The Journal of Visualized Experiments. (30), (2009).
- Ferrera, R., Benhabbouche, S., Bopassa, J. C., Li, B., Ovize, M. One hour reperfusion is enough to assess function and infarct size with TTC staining in langendorff rat model. Cardiovascular Drugs and Therapy. 23 (4), 327-331 (2009).
- Sutherland, F. J., Shattock, M. J., Baker, K. E., Hearse, D. J. Mouse isolated perfused heart: Characteristics and cautions. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 30 (11), 867-878 (2003).
- Reichelt, M. E., Willems, L., Hack BA, ., Peart, J. N., Headrick, J. P. Cardiac and coronary function in the langendorff-perfused mouse heart model. Experimental Physiology. 94 (1), 54-70 (2009).
- Xie, M., et al. Histone deacetylase inhibition blunts ischemia/reperfusion injury by inducing cardiomyocyte autophagy. Circulation. 129 (10), 1139-1151 (2014).
