To study the interaction of bacteria with the blood vessels under shear stress, a flow chamber and an in vivo mesenteric intravital microscopy model are described that allow to dissect the bacterial and host factors contributing to vascular adhesion.
Endovasküler enfeksiyonları ve infektif endokardit neden olmak için, bakteriler, kan akışı kesme stresine maruz kalma sırasında damar duvarına yapışma mümkün olması gerekmektedir.
Mikroorganizmaların damar yapışmasına katkıda bakteriyel ve konakçı faktörleri belirlemek için, fizyolojik kayma koşulları altında bu etkileşimleri çalışmak uygun modeller ihtiyaç vardır. Burada, biz ekstraselüler matriksin farklı bileşenleri bakteriyel yapışma araştırmak ya da endotel hücrelerine sağlayan bir in vitro akış odası modeli tarif ve geliştirilmiş bir intravital mikroskopi modeli doğrudan in vivo splanknik dolaşıma bakterilerin ilk yapışma görselleştirmek için . Bu yöntemler akışı altında bakteri yapışma için gerekli bakteriyel ve ana faktörleri tanımlamak için kullanılabilir. Biz kayma gerilmesi alaka ve staphy yapışması için von Willebrand faktör rolünü göstermektedirlococcus aureus, hem in vitro hem de in vivo modelinde kullanılmıştır.
To establish endovascular infections, pathogens require a mechanism to adhere to the endothelium, which lines the vessel wall and the inner surface of the heart, and to persist and establish an infection despite being exposed to the shear stress of rapidly flowing blood. The most frequent pathogen causing life-threatening endovascular infections and infective endocarditis is Staphylococcus aureus (S. aureus)1.
Various bacterial surface-bound adhesive molecules mediate adhesion to host tissue by interacting with extracellular matrix components. These MSCRAMMs (microbial surface components recognizing adhesive matrix molecules) recognize molecules such as fibronectin, fibrinogen, collagen and von Willebrand factor (VWF). MSCRAMMs are important virulence factors of S. aureus and are implicated in the colonization and invasion of the host2. Most studies on these virulence factors have been performed in static conditions, and thus may not be representative for human infections where initial adhesion of the bacteria occurs in flowing blood.
In the case of bloodstream infections, bacteria need to overcome the shearing forces of flowing blood in order to attach to the vessel wall. Models that investigate the interaction between bacteria and endothelium or subendothelium under flow conditions are therefore of particular interest.
A recent study showed that the adhesion of S. aureus to blood vessels under shear stress is mediated by VWF3. VWF, a shear stress-operational protein, is released from endothelial cells upon activation. Circulating VWF binds to collagen fibers of the exposed subendothelial matrix. Our group reported that the von Willebrand factor-binding protein (vWbp) of S. aureus is crucial for shear-mediated adhesion to VWF4.
In this article, we present an in vitro flow chamber model where bacterial adhesion to different components of the extracellular matrix or to endothelial cells can be evaluated. To validate the findings from in vitro data, we have developed an in vivo model that visualizes and quantifies the direct interaction of bacteria with the vessel wall and the formation of bacteria-platelet thrombi in the mesenteric circulation of mice, using real-time intravital vascular microscopy.
Kesme gerilmesi damar duvarına erken bakteriyel yapışma ve endovasküler veya endokardiyal vejetasyon ve metastatik enfeksiyonların 4,5 müteakip nesil için çok önemli bir faktördür. Fizyolojik makaslama gerilimi altında endovasküler enfeksiyonların hastalık oluşumunun incelenmesinde, in vitro ve in vivo modellerde tamamlayıcı tarif. Bu modeller bize büyük S. olarak von Willebrand faktör bağlayıcı protein (vWbp) tanımlamak için izin aureus protein VWF 4 açığa yaralı bir damar duvar ile akış altında etkileşim.
Endovasküler enfeksiyonları ve özellikle enfektif endokardit, aynı zamanda, çünkü yerel ve uzak ('metastatik'), komplikasyon, çünkü sadece sepsis kaynaklı organ yetmezliği ve ölüm endişe vardır. Enfektif endokardit ve metastatik enfeksiyonlara neden için, bakteri damar duvarına yapışır ve böylece kan akan kayma gerilmesi karşı zorunda. Çoğubakteriler üzerinde çalışmalar faktörleri statik koşullarda yapılmıştır virülansa. Ancak, bu kurulan etkileşimleri bakteri-konak etkileşimi yeni, daha önceden tanınmayan faktörleri ortaya çıkarabilir akış şartlarında kesme kuvvetlerini ve çalışmalar dayanacak olmayabilir.
Mikro paralel bir akış odasından kullanarak, ve diğerleri, vasküler yapışma VWF önem taşıdığını göstermiştir. Makaslama stres altında giderek Unfolds dinlenme küresel yapıdan VWF ve onun GPIb reseptörü 6 vasıtasıyla trombositler ile etkileşime A1 alanını ortaya çıkarır. Akış odaları yoğun trombosit fonksiyonu 7 incelemek için kullanılmıştır.
Dikkate değer, ayrıca S. akış altında aureus yapışma kesme sırasında maruz A1 etki VWF gerektirir, ve özellikle. Biz vWbp VWF bağlayıcı arabuluculuk belirledi. vWbp S. katkıda bulunan bir koagülaz olduğunu Ev sahibinin protrombini aktive ederek aureus patofizyoloji. Staphylothrombin, resbakteriyel Koagulaz ve protrombin kompleksi ulting, çözünmeyen fibrin 8,9 içine fibrinojen dönüştürür. Çalışmalarımız vWbp sadece protrombini aktive etmediğini göstermiştir, ancak akış 4,10,11 altında kan damarlarının yapışmasını geliştirmek bakteri fibrin-trombosit agrega, oluşumunu tetikler var.
in vitro akış odası modeli hücresel veya matris bileşenleri bakteriyel yapışma farklı oyuncuları çalışma sağlar. Bakteriyel virülans faktörleri spesifik yüzey proteinleri ifade mutantlar veya zararsız bakteriler kullanılarak incelenebilir. Seçenek olarak ise, farmakolojik inhibitörleri ya da bloke edici antikorlar, akış odasının ortama ilave edilebilir. gibi hücre dışı matrisin farklı bileşenler olarak ana faktörlerin rolü farklı kaplamalar ile lamelleri kullanılarak incelenebilir. lamelleri da aktivasyon durumu spesifik stimülatörlerinin eklenerek modüle edilebilir olan endotel hücreleri ile kaplı olabilir. Apavasküler duvar RT konakçı kan hücreleri ve plazma proteinlerinin katkısı akan ortam için bu faktörleri eklenerek incelenebilir. Böylece, artan karmaşıklık farklı koşullar bakteri in vivo damar duvarına yapışma sağlayan etkileşimleri çözülmeye laminer akış standart koşullar altında incelenebilir.
In vitro modelde tanımlanan etkileşimi, daha sonra, bir organizma içindeki önemini test etmek için bir hayvan modelinde incelenmiştir. Akış altında dinamik etkileşimler üzerinde çalışmak için in vivo modeller tür diğer hamsteri dorsal deri altı bölme 12 ve cremaster modeli 13 olarak tarif edilmiştir. Buna karşılık, burada açıklanan mezenterik perfüzyon modeli, olasılık farelerin genetik arka plan ev sahipliği değişir ve farmakolojik müdahalelerin değerlendirilmesi nedeniyle kullanım kolaylığı ve çeşitli avantajlar sunuyor.
Sonuç olarak, modeller tarifS. sadece yüzey proteinleri çalışma imkanı sunuyoruz aureus, ancak farklı konakçı geçmişleri diğer birçok mikroorganizma, daha iyi damar enfeksiyonlarının patogenezi anlamak için.
The authors have nothing to disclose.
Bu eser Fonds voor Wetenschappelijk onderzoek (FWO) Vlaanderen G0466.10, 11I0113N tarafından desteklenmiştir; Pediatrik Kardiyoloji, UZ Leuven, Belçika "Eddy Merckx Araştırma Bursu" ve "Sporta araştırma Hibe" (JC); Moleküler Biyoloji ve Damar Merkezi Leuven Üniversitesi'nden "Geconcentreerde Onderzoeksacties" (GOA 2009/13) ve Boehringer-Ingelheim bir araştırma bursu ile, Programmafinanciering KU Leuven (PF / 10/014) tarafından desteklenmektedir.
Brain Heart Infusion (BHI) | BD Plastipak | 237500 | |
Tryptic Soy Broth (TSB) | Oxoid | CM0129 | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Invitrogen | 14190-169 | D-PBS |
5(6)-carboxy-fluorescein N-hydroxysuccinimidyl ester | Sigma-Aldrich | 21878-25MG-F | fluorescent labeling |
Bovine Serum Albumin Fraction V (BSA) | Roch | 10 735 086 001 | |
Haemate-P | CSL Behring | PL 15036/0010 | VWF |
Horm collagen | Takeda | 10500 | collagen |
1-well PCA cell culture chambers | Sarstedt | ######## | plastic slips |
Temgesic | Reckitt Benckiser | 283716 | bruprenorphine |
Anesketin (Ketamin hydrochloride 115 mg/ml (100 mg/ml ketaminum)) | Eurovet | BE-V136516 | ketamin |
XYL-M 2% (xylazine hydrochloride 23.32 mg/ml (20 mg/ml xylazine)) | VMD Arendonk | BE-V170581 | xylazine |
2 french intravenous catheter green | Portex | 200/300/010 | |
0,9% Sodium chloride (NaCl) | Baxter Healthcare | W7124 | |
cotton swabs | International Medical Product | 300230 | |
Ca2+-ionophore solution A23187 | Sigma-Aldrich | C7522-10 MG | |
26 gauge 1 ml syringe | BD Plastipak | 300013 | |
26 gauge 1 ml syringe with needle | BD Plastipak | 300015 | intra-peritoneal injection |
Centrifuge 5810-R | Eppendorf | 5811 000.320 | |
Glass cover slips (24×50) | VWR | BB02405A11 | Thickness No, 1 |
PHD 2000 Infusion | Harvard Apparatus | 702100 | High-accuracy Harvard infusion pump |
Axio-observer DI | Carl-Zeiss | Inverted fluorescence microscope | |
ImageJ | National Institute of Health | Analysis software | |
Graphpad Prism 5,0 | Graphpad Software | Analysis software | |
AxioCam MRm | Carl-Zeiss | Black and white camera |