Si bien el análisis alta resolución de fusión ofrece la capacidad de diferenciar entre polimorfismos de nucleótido único en una población heterogénea, alelo mutante sesgo de amplificación puede aumentar su capacidad para detectar alelos presentes en porcentajes relativamente bajos dentro de una muestra. Este protocolo describe las mejoras que mejoran la sensibilidad del análisis de fusión de alta resolución.
A pesar de décadas de esfuerzos de erradicación, la malaria sigue siendo una carga global. Renovado interés reciente en la eliminación regional y la erradicación mundial se ha visto acompañado por un aumento de la información genómica sobre Plasmodium especies de parásitos responsables de la malaria, incluyendo características de las poblaciones geográficas, así como las variaciones asociadas con susceptibilidad reducida a los medicamentos contra la malaria.
Una variación genética común, polimorfismos de un solo nucleótido (SNP), ofrece objetivos atractivos para el genotipado parásito. Estos marcadores son útiles no sólo para el seguimiento de los marcadores de resistencia a los medicamentos, sino también para el seguimiento de las poblaciones de parásitos utilizando marcadores no menores de drogas u otras presiones selectivas.
Métodos de genotipificación de SNP ofrecen la posibilidad de realizar un seguimiento de resistencia a los medicamentos, así como tomar las huellas dactilares parásitos individuales para la vigilancia de la población, sobre todo en respuesta a los esfuerzos de control de la malaria en regiones acercan Eliminatestado iónico.
Mientras SNPs informativos han sido identificados que son agnósticos a las tecnologías de genotipado específicos, de alta resolución de fusión (GRH) análisis es especialmente adecuado estudios basados campo-a. En comparación con los métodos estándar fluorescente sonda basados que requieren SNPs individuales en una sola sonda marcada y ofrecen, en el mejor 10% de sensibilidad para detectar SNPs en muestras que contienen múltiples genomas (polygenomic), gestión de recursos humanos ofrece 2.5% de sensibilidad. Modificaciones a HRM, tales como sondas bloqueadas y concentraciones de cebador asimétricos, así como la optimización de temperaturas de recocido de amplificación para PCR sesgo hacia la amplificación de la alelo menor, aumentar aún más la sensibilidad de HRM. Aunque la mejora de sensibilidad depende del ensayo específico, hemos aumentado la sensibilidad de detección a menos del 1% del alelo menor.
En las regiones se acercan a la erradicación de la malaria, la detección temprana de emergentes o resistencia a los medicamentos importados es esencial para la prrespuesta OmpT. Del mismo modo, la capacidad de detectar infecciones polygenomic y diferenciar tipos de parásitos importados de embalses locales crípticas puede informar a los programas de control.
Este manuscrito describe modificaciones a la tecnología de fusión de alta resolución que aumentan aún más su sensibilidad para identificar infecciones polygenomic en muestras de pacientes.
A pesar del renovado interés en el control de la malaria y la erradicación, la malaria sigue siendo una carga para todo el mundo, con casi la mitad de la población mundial corre el riesgo de infección y más de 550.000 muertes al año, en particular los niños en África subsahariana 1.
Estos nuevos programas de control y erradicación han sido apoyados por el renacimiento genómico, con un gran número de parásitos de la malaria secuenciados y analizados por mutaciones asociadas con una menor sensibilidad a los fármacos, el aumento de la virulencia y de características de la población 2,3. Polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) son algunas de las variantes genéticas más comúnmente identificados 4-7.
Métodos portátiles genotipado de SNP ofrecen en el establecimiento y vigilancia de la población y en tiempo real el seguimiento de 8. Además de las huellas digitales de los parásitos individuales, el "código de barras molecular también se utiliza para detectar cambios temporales dramáticos en frecuencia de los alelosasí como la variación del tamaño efectivo de la población y la complejidad de la infección 9.
Si bien este conjunto de informativo SNPs se adapta fácilmente a muchas plataformas de genotipado, de alta resolución de fusión (GRH) análisis está particularmente bien adaptado a los estudios, en el funcionamiento y la detección de nuevas mutaciones en los bajos costos sensible y simple en comparación con la secuencia y otro campo de base enfoques son atractivos en entornos de escasos recursos.
HRM comienza con la reacción en cadena de la polimerasa estándar (PCR) que incorpora un colorante fluorescente. Post-PCR análisis de fusión determina la temperatura máxima amplificación de fusión; una única diferencia de SNP en un corto amplicón puede resultar en sustancial de temperatura pico de fusión (Tm) diferencias.
Varias mejoras a este método ofrecen mejor resolución genotipado para diferenciar SNPs incluidos SNPs clase IV (AT), y detectar alelos mutantes de menor importancia en las muestras con múltiples alelos presentes (poliGinfecciones enomic). En primer lugar, los ensayos incorporan sondas cortas centrado sobre la región SNP, además de cebadores directo e que están presentes en diferentes concentraciones revertir. Estas sondas bloqueados no se amplifican durante la PCR, pero se unen a la cadena producida en exceso debido a concentraciones de cebador asimétricos que aumentan la producción del producto sonda de plantilla. Estos amplicones de doble cadena separados formados por sonda unida al exceso cadena molde son ~ 20-30 pb; su longitud disminuyó significativamente en comparación con todo el amplicón (de 80-150 pb) conducen a diferencias mucho más grandes Tm asociados con la base única o múltiple sonda de plantilla desajustes 10.
En segundo lugar, el sesgo de amplificación alelo mutante (MAAB) reduce la temperatura de recocido reacción al sesgo la reacción hacia alelos mutantes presentes en bajas proporciones en las infecciones polygenomic. La temperatura de hibridación se establece entre las Tms de perfectamente coincidente (de tipo salvaje) y coinciden sonda (mutante)s. A esta temperatura, la unión del alelo de tipo salvaje es lo suficientemente estable que la amplificación se ve obstaculizado en comparación con su falta de coincidencia equivalente, sesgando así la amplificación hacia el alelo mutante cuando ambos están presentes en una sola muestra 10.
Con estos refinamientos HRM, esta tecnología ha permitido el seguimiento de los orígenes y la identidad de parásitos asociados con infecciones epidémicas en América del Sur 11 y la detección de nuevas mutaciones, diferenciación de múltiples SNPs situados inmediatamente uno junto al otro en secuencia, y las mutaciones presentes en menos de 1 % de los alelos en muestras polygenomic 10.
Aumento de la sensibilidad es particularmente importante en las regiones que se acercan estado de pre-eliminación y aquellos en riesgo de emergente resistencia a los medicamentos. La capacidad para identificar rápida y fácilmente los parásitos y SNPs importados asociados con una menor sensibilidad en el sitio informa los esfuerzos de vigilancia y los programas de control sobrela efectividad de sus implementaciones e identifica puntos de acceso para mayores esfuerzos de erradicación de la malaria y de eliminación. Este protocolo describe los métodos para la sonda bloqueado con sede y MAAB para una mayor sensibilidad genotipado HRM.
Continua HRM es una etapa de análisis post-PCR; Por lo tanto, la muestra y la configuración de ensayo es similar a protocolos de PCR estándar, con la incorporación adicional de un colorante intercalante fluorescente utilizado para rastrear la transición de doble cadena a ADN monocatenario durante la etapa de fusión de alta resolución. El factor más importante para el análisis de gestión de recursos humanos con éxito es un producto de PCR robusto. Diseño del ensayo es la clave, y varias herramientas optimizadas para el diseño de ensayo de gestión de recursos humanos están disponibles en el mercado y en línea 13. Longitudes de amplificación de 80-150 pares de bases con el acompañamiento de ~ 20 pares de bases bloquearon sondas sobrevolaron el SNP o SNP de interés el trabajo mejor para diferenciar SNPs y haplotipos de múltiples SNPs dentro de la región de la sonda. Las sondas pueden ser bloqueados usando un 3 'C3 espaciador o un par desajuste 2 de base en el extremo 3', que impiden la extensión durante la amplificación. Las sondas se pueden diseñar para que coincida con la cadena de Watson Crick o plantilla; la eleccióndepende de la comprobación empírica para determinar qué sonda de diseño produce picos de fusión aceptables. El exceso hacia delante o hacia atrás primers se utilizan para producir producto de amplificación de cadena sencilla que hibrida con las sondas bloqueadas. Si la sonda contiene la secuencia de la cadena hacia adelante, luego cebador inverso se utiliza en exceso, por lo general en una proporción de 1: 5, y viceversa para las sondas que coinciden con la cadena inversa.
Del mismo modo, HRM funciona mejor con suficiente y robusto producto de PCR. La optimización de la reacción PCR requiere geles de gradiente de PCR y análisis de agarosa o Bioanalyzer para determinar la temperatura óptima de recocido. Plantilla de concentración se puede aumentar usando métodos tales como pre-amplificación, la amplificación multiplexado sesgada de todos los objetivos utilizando concentración del cebador bajo y números de ciclo para aumentar la concentración de molde 13.
Sólo un puñado de instrumentos son compatibles con MAAB. Las propiedades térmicas de los tubos capilares de vidrio usado in estos sistemas facilitan este método. El pequeño diámetro interior de los capilares, así como la rápida transferencia de calor a través del vidrio ofrecen un control de temperatura más riguroso que plasticware PCR estándar, que tiene tasas de transición más lentas de recocido entre ciclos de desnaturalización y debido a las propiedades de aislamiento térmico de los plásticos. Con este método, las sensibilidades de detección pueden reducirse a partir de 2-5% a menos del 1% de un alelo mutante en una mezcla de tipo salvaje y los alelos mutantes 10.
Gestión de recursos humanos es una herramienta fácil, eficiente y económica para SNP genotipo en una variedad de configuraciones y numerosas aplicaciones, desde la vigilancia de enfermedades infecciosas para la exploración de variantes genéticas del cáncer. Varios otros instrumentos, como la Roche Nano y sistemas LightCycler (480 y 96), así como el Eco en tiempo real ofrece el sistema PCR HRM, además de la amplificación estándar, en tiempo real, y la funcionalidad de número de copias. El uso de máquinas de alto rendimiento, cuesta códigos de barras gestión de recursos humanos less de $ 0.50 por ensayo en nuestras manos, que incluye todos los reactivos y consumibles.
En el contexto descrito aquí, las aplicaciones basadas en el terreno permiten la vigilancia de la población en tiempo real para los cambios asociados con los esfuerzos de control de la malaria, incluyendo reducida diversidad de la población, la detección de tipos de parásitos importados, y la aparición y propagación de SNPs asociados con una menor sensibilidad a los fármacos. Perfeccionamiento del método ofrecen sensibilidad adicional útil para informar el progreso hacia la eliminación de la malaria y erradicación.
The authors have nothing to disclose.
Los autores agradecen a la Fundación Bill y Melinda Gates, por su apoyo al desarrollo de la tecnología y la formación.
LightScanner Master Mix | BioFire Defense | HRLS-ASY-0003 | |
Light mineral oil | Sigma | M5904 | for BioFire Defense plate-based HRM systems |
TE | Teknova | T0226 | |
Te | Teknova | T0221 | TE buffer with reduced EDTA |
PCR grade water | Teknova | W3330 | |
Plasmodium falciparum standards | MR4 | MRA-151, 156, 205, 330 | MR4.org offers free genomic DNA |
Light Scanner Primer Design Software | BioFire Defense | commercial sofware for HRM assay design | |
LightCycler 480 High Resolution Melting Master Mix | Roche | 4909631001 | For use in LightCycler-480, -96, and nano. 2x concentration |
Bioanalyzer | Agilent | G2938A | Agilent 2100 bioanalyzer |
LightCycler 2.0 | Roche | 3531414001 | Capillary-based system for MAAB |
LightCycler Nano | Roche | 6407773001 | Strip tube-based HRM and amplification |
LightCycler 96 | Roche | 5815916001 | Strip-tube and plate-based HRM and amplification |
LightCycler 480 | Roche | 5015278001 | plate-based HRM (96 and 384-well plates) and amplification |
LightScanner-96 | BioFire Defense | LSCN-ASY-0011 | plate-based HRM (96-well) |
LightScanner-384 | BioFire Defense | LSCN-ASY-0001 | plate-based HRM (96-well) |
96-well plates | Roche | 4729692001 | 96-well plates for HRM (LightCycler |
384-well plates | Roche | 4729749001 | 384-well plates for HRM (LightCycler) |
96-well plates | Bio-Rad | HSP-9665 | 96-well plates for HRM (LightScanner) |
384-well plates | Bio-Rad | HSP-3865 | 384-well plates for HRM (LightScanner) |
LightCycler 8-Tube Strips (clear) | Roche | 6327672001 | strip tubes for HRM (Light Cycler 96 and Light Cycler Nano) |
LightCycler Capillaries (20 μl) | Roche | 4929292001 | capillaries for HRM |
Optical plate seals | Roche | 4729757001 | other brands also work |