長期培養インターフェロンγ酵素結合免疫アッセイは、中央メモリー応答の尺度として用い、保護抗マイコバクテリアワクチン応答と相関されます。このアッセイでは、末梢血単核細胞を、分化、中央メモリーT細胞の拡大を可能にする、14日間マイコバクテリア抗原およびインターロイキン2で刺激します。
エフェクターおよびメモリーT細胞は、抗原認識以下のナイーブ細胞の発達プログラミングにより生成されます。感染は、拡張期の間に生成さT細胞の95%までに制御されている場合は除去される( すなわち 、収縮期)およびメモリーT細胞は、時々一生残ります。ヒトでは、メモリーT細胞の機能的に異なる2つのサブセットは、リンパ節ホーミング受容体の発現に基づいて説明してきました。セントラルメモリーT細胞は、CCケモカイン受容体7、CD45ROを発現し、主に二次リンパ器官のT細胞領域に配置されています。エフェクターメモリーT細胞は、CD45ROを発現する末梢または炎症組織へのリンパ球ホーミングに関連するCCR7とディスプレイの受容体を欠いています。エフェクターT細胞はCCR7またはCD45ROが、このようなインターフェロンγなどの抗原の生産のエフェクターサイトカイン、との出会いの際にどちらかを発現しません。インターフェロンγ放出アッセイは、ウシおよびヒトの結核の診断のために使用され主にエフェクターとエフェクターメモリーT細胞応答を検出します。非ヒト霊長類、マウスにおける結核、およびヒトにおけるマラリアのサル免疫不全ウイルス感染に示されたようにワクチン接種にCD4 + T細胞によるセントラルメモリーT細胞応答が、一方、ワクチンの有効性を予測するために使用することができます。マウス及びヒトならびに家畜上の未発表のデータにいくつかの研究は、インターフェロンγELISPOTアッセイは、中央メモリーT細胞応答を測定することを実証しました。このアッセイでは、末梢血単核細胞を、10〜14日(長期間培養)のための抗原の濃度を減少させるエフェクター応答がピークと衰退させることで培養します。文化の中で区別し、拡大するために中央メモリーT細胞を容易にします。
エフェクターおよびメモリーT細胞は、抗原認識後のナイーブCD4 + T細胞の発達プログラミングにより生成されます。サイトカイン産生細胞へのナイーブCD4 + T細胞の分化は、先天性免疫細胞、T細胞共刺激偏サイトカイン産生を生じる転写変化の抗原提示による病原体の認識を必要とします。たとえば、抗原提示細胞は、一緒に抗原認識に、シグナル伝達および活性化因子を介したシグナル伝達によりTヘルパーに1(のTh1)細胞1,2 T細胞の分化を促進し、細胞内病原体に応答して、インターロイキン(IL)-12を産生します転写4(STAT4)とTボックスは、細胞活性化、IL-2産生、クローン性増殖およびインターフェロン(IFN)-γ産3,4に至る、T細胞(T-BET)で表されます。感染が制御されている場合は、拡張期の間に生成されたT細胞の最大95%が除去される( すなわち 、収縮相)及び記憶T細胞は、時々 、寿命5のために、残っています。 Sallusto ら 6、リンパ節ホーミング受容体の発現に基づいて、ヒトにおけるメモリーT細胞の機能的に異なる2つのサブセットを明らかにしました。セントラルメモリーT細胞(TCM)は、CCケモカイン受容体(CCR)-7およびCD45ROを発現し、主に二次リンパ器官のT細胞領域に配置されています。 TCMは、エフェクター機能、低活性化閾値を限定し、高IL-2生産及び増殖能力を保持しています。エフェクターメモリーT細胞(TEM)CD45ROを発現し、末梢または炎症組織へのホーミングのためCCR7とディスプレイの受容体を欠いています。エフェクター細胞は、CCR7またはCD45ROのいずれかを発現するが、速やかに抗原認識時に、IFN-γなどのエフェクターサイトカインを産生しません。
IFN-γ放出アッセイ(IGRA)は、ウシおよびヒト結核7の診断に使用されている。 ウシ結核菌 、ウシ結核(BTB)の主要な薬剤である人間のCAながら結核のSESは、 結核菌によって主に引き起こされます。これらの試験では、全血または末梢血単核細胞(PBMC)は、16〜24時間、マイコバクテリア抗原で刺激し、上清中でIFN-γ産生をELISAによってまたはELISPOT技術を用いてIFN-γを産生する細胞の検出によって測定される。と短い刺激期間( すなわち 、16〜24時間)、および迅速なサイトカイン産生の結果として、 エクスビボアッセイは、主にエフェクターおよびTEMの応答を検出します。これは、これらの培養物8-10中の細胞集団のフローサイトメトリー分析によって確認されました。
エクスビボ IFN-γ応答は、日常的に家畜による応答を評価するために使用されるものを含む、結核ワクチンの免疫応答パネル評価に含まれます。最も効果的な牛結核ワクチンは、特異的IFN-γ応答を誘発するが、IFN-γ応答を誘導しないすべてのワクチンがprotectivですE。また、ワクチン接種によって誘発されるIFN-γのレベルは、感染の前に測定されるように、必ずしも保護と相関しません。例えば、異なるBCG株は、同様の保護レベル11にもかかわらず、 エクスビボでのIFN-γ応答を誘導する異なる能力を有することができます。したがって、ex vivoで IGRAsは結核診断のためのワクチンの免疫原性にアクセスするために価値があります。しかしながら、ワクチンの有効性の予測因子としてのそれらの使用は制限されます。ワクチン接種に対するTCM応答が、一方、ヒト15,16のマウス14及びマラリアにおける結核、非ヒト霊長類12,13におけるサル免疫不全ウイルス(SIV)感染に示されているように、ワクチンの有効性を予測するために使用することができます。
病原体のクリアランスをもたらす効果的な免疫応答の後、TCMが維持され、同じエージェントによって最終的に二次感染に対する保護を提供します。このシナリオに注目すべき例外は、Mです。結核 infe患者が治癒、抗マイコバクテリア療法を受けている人間のction再感染17,18に感受性です。さらに、慢性感染の間に免疫記憶を支配するイベントは、抗原刺激が持続する特徴、ウェル19を理解されていません。例えば、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、結核のように慢性感染症、間に、かなりのTCM応答が良好な転帰(結核とHIVとの不顕性疾患を有する例えば 、待ち時間)20,21と関連しています。マウスとヒトとのいくつかの研究は、長期培養し、IFN-γELISPOTアッセイは、TCM応答16,20-22を測定することを実証しました。このアッセイでは、PBMCをエフェクター応答がピークと衰退することを可能にする、10〜14日間の抗原の濃度を減少させることで培養されます。差別と文化の中で展開してTCMを容易にします。
長期培養したIFN-γELISPOTアッセイはまた、獣医学において使用されています研究、まだ応答細胞の表現型が原因で、重要な試薬の不足、CCR7に特に抗体に評価することは困難でした。効果的な牛結核ワクチン[ 例えば 。 Mの単回投与を使用して、 ボビスカルメット·ゲラン桿菌(BCG)、BCGは、保護( すなわち 、より低いマイコバクテリア負担と相関ワクチン接種後の長期培養し、IFN-γELISPOT応答を誘発ボビス ΔRD1]。ウイルスベクター化抗原85Aサブユニットワクチン、または弱毒化したMが続き、減少病原性M.とその後のチャレンジに対するTB-関連する病状) ボビス 23,24。また、長期的なPBMC培養物内の抗原特異的IFN-γ分泌細胞の数は12ヶ月で高くなっているが、保護、検出ポストMの程度と相関し、新生児ふくらはぎのBCGワクチン接種後24ヶ月で減少しますボビスチャレンジ 25。このシナリオでは、培養されたIFN-γELISPOTであります高コストの有効性試験のためのワクチン候補の優先順位を決定するための手段を提供し、ワクチンの有効性を予測するためのn個の重要なツール。さらに、培養ELISPOT技術は、異なる研究分野における様々な目的のために、抗原または抗体を改変することによって様々な宿主、病原体およびサイトカインに適合させることができます。
長期培養ELISPOTアッセイにおけるIFN-γ産生は、ヒトにおいて、一般的にTCMに起因するものであるが、どのようにこの応答は、培養に発症することは十分に理解されていません。かどうかTCMは、循環中に存在し、in vitroで拡大、またはTCMの応答が培養中にTCMへのエフェクターおよびTEM細胞の分化に起因する場合は知られていません。しかし、ヒト由来の試料を用いた研究は、ex vivoおよび長期培養IFN-γELISPOTアッセイからのCD4 + T細胞は、TCM応答は、エフェクター細胞28から発生しないことを意味する、無関係なエピトープ特異性を有することを見出しました。明らかに、応答の持続時間は異なるが、病原体のクリアランスが達成された場合、最終的には両方のex vivoおよびTCMの応答が低下します。また、初期の測定長期培養の応答と長い抗原プライミングした後(エフェクター応答が低い)相関することが示されている、抗後の早いTCM集団を循環し、長いことを示していますジェニックプライミングは、 生体内で関連のままである。一方、ex vivoでの応答の大きさは、記憶応答29の大きさに関係すると表示されません。これらの結果は、長期培養したIFN-γのELISPOT応答がTCM のインビトロ拡大し、試料中のエフェクター応答の関連衰退ではなく、TCM表現型へのエフェクター細胞の分化に起因することを示唆しています。
牛では、長期的IFN-γELISPOTアッセイにより検出された応答のエフェクターおよびメモリーサブセットの相対的な寄与は知られていません。最近の研究では、ワクチンとの相関関係が長期培養し、IFN-γELISPOT応答とMとその後の実験感染に対する保護を誘発示しますボビス 23-24。これはワクチン接種に対する弱い長期IFN-γのELISPOT応答が保護30の欠如に関連していることが報告されています。両方が住んでいると殺しますEDワクチンは、同様のex vivoでのIFN-γELISPOT応答を誘導するが、生BCGでのワクチン接種は、ワクチン製剤を殺したんよりも強い、長期培養し、IFN-γELISPOT応答を誘発します。殺された製剤は、病原性結核性マイコバクテリア31-32、33で攻撃に対する保護を提供するために失敗しながら興味深いことに、生ワクチンは、保護されています。
TCM応答の評価は、PBMCから、これらの細胞を選別することによっても実現可能です。 PBMCからのTCMの直接濃縮は、しかしながら、非常に個人的な訓練を受けた高価な装置を必要とし、これらの細胞は、血流中の多数ないので困難です。 PBMCの長期培養は、高価な装置なしTEM及びエフェクター細胞上のTCMの濃縮を提供します。これらのT細胞集団をインビトロで増殖されているのでしかし、それらは、 インビボ記憶応答の少ない表すことができます。これは、長期培養またはTCMの並べ替えを使用して(IFN-γメモリ応答をアクセスすることが可能ですサイトカインのELISA 34、サイトカインビーズアレイ(CBA)、細胞内染色(ICS)、またはサイトカインタンパク質アレイ(CPA)のようなELISPOTアッセイによって以外の戦略)る。これらの方法は、しかし、一般的にELISPOTは35をアッセイよりも感度が低いです。
ELISPOTの利点はすぐに他の細胞による酵素的切断またはサイトカイン取り込みによる上清および分解の希釈を防ぐ、そのリリース後のサイトカインの直接の取り込みを検出する能力です。 ELISPOTアッセイは、ノイズのシナリオ( すなわち、低特異的応答)35にあっても低信号に正確な結果を提供するサイトカインを産生する単一細胞を検出します。また、ICSで、リリース前にサイトカインの検出は、サイトカインを産生する細胞の偽の身分証明書をもたらすことができる( 例えば 、原因分泌プロセスの前または間に、翻訳後調節に)34。サイトカイン分泌を最小にするためにICSアッセイで用いられる輸送阻害剤(タンパク質を停止ゴルジとして知られている)抗原刺激中に最終的にサイトカイン産生35に影響を与えるこれらのタンパク質の細胞毒性による細胞刺激の持続時間を制限します。
そうは言って- ( すなわち 、ICSに)CBA、CPAおよびICSおよび/ または細胞表面マーカーの発現を決定するために、同時に複数のサイトカインを測定するために有用な技術です。したがって、これらの方法は、IFN-γELISPOTアッセイ36と組み合わせて使用することができます。 ELISPOTアッセイを介してTCM応答を測定し、前のウシ結核ワクチンの有効性の研究が、他の技術によって、TCM応答の検出は、おそらく同等の結果が得られます。重要なことは、ELISPOTアッセイは、CBA、CPAおよびICS分析技術34よりも実行するために、安価で簡単です。 SFCの手動カウントが自動化された計数の代替であり、ELISPOTプレートは、スポットCの前または後に、最低限の品質損失で長時間室温で保存することができます37 ounting。
結核ワクチン応答を評価する際に、長期培養し、IFN-γELISPOT応答は、人間が記憶応答を評価するために適用され、牛された14-16,31-32,33。 TCMの応答はまたのような牛のいくつかの他の感染物質に宿主応答において重要な役割を果たしているものとする: マイコプラズマミコイデスサブスピーシーズミコイデス 42、 アナプラズマmarginale 38およびウシ呼吸器合胞体ウイルス39。潜在的には、長期的なELISPOTアッセイは、他の動物種、サイトカインおよび感染症のために適合されることがあります。これらのより広範なアプリケーションでは、特定の試薬の現在の限られた在庫状況により、獣医学、免疫学の用途に特に有用であろう。
TCMの応答は、いくつかの感染に対する保護のために重要であるが、MA(疾患の転帰の予測またはワクチンの有効性のために)感染/免疫後早期にそれらを測定しますyが煩雑になります。 エキソビボ短抗原刺激条件下で免疫応答の分析は、多くの場合、特に、免疫学的記憶形成の開始時に、原因メモリとエフェクター応答の重なりに、エフェクター応答を表します。抗原負荷が継続的である慢性疾患の文脈においては、ex vivoでの応答は、エフェクター細胞応答または記憶およびエフェクター細胞応答の組み合わせを評価します。長期培養したIFN-γELISPOTアッセイは、おそらくTCM応答ではなく、エフェクターT細胞または結合CD4 + T細胞応答を測定することができる、ここで説明します。要約すると、長期培養したIFN-γELISPOTアッセイは、T細胞記憶応答を推定するための貴重なアプローチを提供し、感染剤の様々ないくつかの種の記憶応答を評価するために首尾よく使用されている12-16、20-25,29 、31,33,34,38,39。
The authors have nothing to disclose.
3625-32000-104農業·食品産業技術総合研究イニシアティブ競争助成なし:研究は、米国農務省、ARSクリスによってサポートされていました。食糧農業のUSDA国立研究所から2011-67015-30736。私たちは、その優れた技術的な支援だけでなく、レベッカマディソン、ダグ·ユーイング、ケイティPille、ジェイ·シュテフェン、デビッド·ルベルスのためのジェシカ·ポロック、エマFrimmlモルガン、シェリージマーマン、クリスティンベース、ブルース·ペッシュ、モリースタフネ、アレン·ジェンセン、およびトレイシー·ポーターに感謝します動物の優れたケアと取り扱いのため、ロビンZeisness、ダビデPanthen。
Sodium citrate (dihydrate) | Various | ||
Citric acid (monohydrate) | Various | ||
Dextrose | Various | ||
ELISPOT PVDF plate | Various | ||
Vectastain ABC – AP KIT Standard | Vector Laboratories | AK-5000 | |
Vector Blue Alkaline Phosphatase Substrate Kit | Vector Laboratories | SK-5300 | |
Ag85A | Lionex | LRP-0004.3 | 23, 24, 25, 37 |
TB 10.4 | Lionex | LRP-0061.6 | 23, 24, 25, 37 |
PPDb | Prionics AG | 7600055 | |
rESAT-6:CFP10 | Kind gift Dr. Minion, Iastate | 23, 24, 25, 27, 37 | |
Mouse anti-bovine IFN-γ Clone CC302 | Serotec | MCA1783B | 23, 24, 25, 27, 37 |
Mouse anti-bovine IFN-γ Biotinylated Clone CC330 | Serotec | MCA2112 | 23, 24, 25, 27, 37 |
Mouse anti-bovine CD4 Clone CC8 | Serotec | MCA1653GA | |
Mouse anti-bovine CD45RO Clone IL116A | Serotec | MCA2434GA | |
Rat anti-human CCR7 Clone 3D12 | Abcam | ab95665 | |
Mouse anti-bovine IFN-γ-Pe Clone CC302 | Serotec | MCA1783PE | |
Goat anti- mouse IgG2a- Alexa Fluor 350 | Invitrogen | A-21130 | |
Goat anti-mouse IgG3 APC-CY7 | SouthernBiotechnology | 1080-193 | |
Goat anti-rat IgG-APC | Invitrogen | A10540 | |
BD Cytofix/Cytoperm™ | BD Biosciences | 554714 | |
BrefeldinA | Sigma-Aldrich | B7651 | |
Pokeweed Mitogen | Sigma-Aldrich | L8777 | |
Recombinat human Interleukin 2 | Sigma-Aldrich | I7908 |