Summary

Erzeugung von rekombinanten humanen IgG monoklonalen Antikörpern aus Immortalisierte Sortiert B Cells

Published: June 05, 2015
doi:

Summary

Synthesis of human monoclonal antibodies is the first step in studies aimed at unraveling the pathophysiological mechanisms of auto-antibody-mediated immune responses. We have developed a protocol to generate recombinant human immunoglobulin G (IgG) monoclonal antibodies from blood sorted B cells, including B-cell isolation, antibody cloning and in vitro synthesis.

Abstract

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, including the development of immunotherapeutics. However, the techniques to identify and produce such antibodies tend to be arduous and sometimes the heavy and light chain pair of the antibodies are dissociated. Here, we describe a relatively simple, straightforward protocol to produce human recombinant monoclonal antibodies from human peripheral blood mononuclear cells using immortalization with Epstein-Barr Virus (EBV) and Toll-like receptor 9 activation. With an adequate staining, B cells producing antibodies can be isolated for subsequent immortalization and clonal expansion. The antibody transcripts produced by the immortalized B cell clones can be amplified by PCR, sequenced as corresponding heavy and light chain pairs and cloned into immunoglobulin expression vectors. The antibodies obtained with this technique can be powerful tools to study relevant human immune responses, including autoimmunity, and create the basis for new therapeutics.

Introduction

Das Ziel dieses Artikels ist, im Detail zu beschreiben eine Methode zur Erzeugung und Charakterisierung human IgG monoklonaler Antikörper aus humanen peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) erhalten.

Das Interesse für die menschliche Antikörper zu untersuchen hat in vielen Bereichen der Forschung gewachsen. Insbesondere sind viele Forschungsgruppen Interesse in der Pathologie von Autoantikörpern verursacht 1-3. Wir kloniert und charakterisiert pathogene Autoantikörper 1. Die Studie von Autoantikörpern kann helfen, ihre Ziele zu identifizieren und therapeutische Strategien zu entwickeln, beispielsweise unter Verwendung von Antikörpern Wettbewerber 4. Außerdem kann die Untersuchung der menschlichen Antikörper auch von Interesse in anderen Forschungsgebieten, dh, um die Immunantwort nach der Impfung 5 zu bewerten, um die Antikörperprofil von Individuen, die belichtet und wurde resistent gegen bestimmte Krankheitserreger 6 bzw. zu untersuchen, wurden die kenn Antikörper sind indas natürliche Repertoire 7,12.

Verschiedene Techniken sind entwickelt worden, um rekombinante menschliche monoklonale Antikörper 8-12 zu erzeugen; die meisten von ihnen verwenden, Phagen-Display und B-Zell-Immortalisation. Die Verwendung von Phagen-Display wurde ausgiebig für die Entdeckung von neuen Antikörpern 13 angelegt. Es hat jedoch einen großen Nachteil, nämlich, daß die schweren und leichten Kettenpaaren des menschlichen Immunglobulins werden in dem Verfahren dissoziiert. Herstellung von Hybridomen mit menschlichen B-Zellen oder EBV-Transformation überwindet diesen Nachteil.

Wir verwenden Infektion von Thymus-B-Zellen mit EBV in Kombination mit polyklonalen B-Zell-Stimulation über Toll-like Rezeptor 9 (TLR-9) 6,12.

In diesem Papier beschreiben wir ausführlich die Technik, die wir für die Entwicklung von menschlichen Antikörpern IgG, mit einem kompletten Überblick über alle Schritte von PBMC Isolierung auf die In-vitro-Antikörpern. DieseProtokoll für die Analyse von jeder Form von menschlichem IgG-Profil verwendet werden. In unserem Labor, B-Zellen, die IgG-Antikörper wurden erfolgreich aus dem Rest der PBMCs nach der Sortierung getrennt. Fünfzig sortiert B-Zellen 8 kann dann in Multiwell-Platten plattiert und mit EBV immortalisiert und TLR-9-Aktivierung, die klonale Expansion von einzelnen B-Zellen sein. Als Feeder-Zellen, Fibroblasten aus menschlichen embryonalen Lungengewebe verwendet wurden, Zellinie WI38, die die Visualisierung der immortalisierten B-Zellen ermöglicht. Von diesen B-Zellen, können die Sequenzen der schweren und leichten Ketten des Immunglobulins durch PCR erhalten werden, und der Antikörper-Gene in Immunglobulin-G-Expressionsvektoren kloniert und in vitro produziert. Mit dieser Technik können einzelne Antikörper mit genau der gleichen Antikörpersequenz in dem Spender gefunden sucht werden.

Protocol

Einwilligung wurde von den Teilnehmern der Studie erhalten. Die Studie wurde von der Ethikkommission genehmigt. 1. Isolierung von peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) Zentrifuge 25 ml heparinisiertem Blut der Teilnehmer bei 900 · g für 15 Minuten, so bald wie möglich nach der Blutentnahme. Wenn es weniger Blut, verkleinern die Reagenzien entsprechend. Führen Sie alle weiteren Schritte in einer Haube. Das Serum in ein sauberes Röhrchen. Es kann in späteren S…

Representative Results

Die Sortierung Gating nach Färbung CD22 und IgG-positiven Zellen wird in Abbildung 1 gezeigt, in diesem Bild die Fläche der doppelt positiven Zellen. – B-Zellen, die IgG-Antikörper – ausgewählt ist, um all diese Zellen in ein separates Röhrchen sortieren. In der Analyse ca. 1% der Gesamt PBMCs entsprechen dieser doppelt positiven Bevölkerung. Die Anzahl der sortierten Zellen erhalten wird von der Anzahl von Zellen in Abschnitt 1 erhaltenen abhängen. Die unterschiedlic…

Discussion

In diesem Manuskript, werden alle Schritte für die Erzeugung von IgG-Antikörpern aus humanen PBMCs im Einzelnen dargestellt. Dieses Protokoll umfasst einige Vorteile gegenüber zuvor veröffentlichten Verfahren. Einer der Vorteile ist, dass die produzierten Antikörpers behält die schweren und leichten Ketten der Vorlage entsprechende Paar in der B-Zell-Klon. Die Identifizierung von IgG-Antikörpern kann in jeder Art von menschlichen Spender durchgeführt werden und es besteht keine Notwendigkeit für Exazerbation de…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Forschungsvertrag Miguel Servet (ISCIII CD14 / 00032) bis (GN-G.). Stipendium der niederländischen Organisation für wissenschaftliche Forschung "Graduate School of Translational Neuroscience Program" (022005019) an (CH).

Zuschüsse aus dem Prinses Beatrix Fonds (Projekt WAR08-12) und der Association Française contre les Myopathien zu (PM-M.); sowie durch eine Veni Fellowship der Niederlande Organisation für wissenschaftliche Forschung (916.10.148) ein Stipendium des Gehirns Foundation der Niederlande (FS2008 (1) -28) und dem Prinses Beatrix Fonds (Projekt WAR08-12) (ML ).

Wir danken Jozien Jaspers für ihre Hilfe in der B-Zellsortierung mittels Durchflusszytometrie.

Materials

Histopaque-1077  Sigma-Aldrich 10771 solution containing polysucrose and sodium diatrizoate
FACSAria II cell sorter  BD Biosciences 
96 U-bottom micro well plates  Costar 3799
Advanced Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium  Gibco, Life Technologies 12633-020
30% v/v EBV-containing supernatant of the B95-8 cell line   ATCC CRL-1612 3.4 x 108 copies/ml
CpG2006  Invivogen ODN 7909
Wi38 cells  Sigma-Aldrich 90020107
Interleukin-2 Roche  10799068001
ELISA plates Greiner Bio-One, Microlon 655092
AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Human IgG, Fcγ Fragment Specific (unconjugated) Jackson ImmunoResearch 109-006-008
4% non-fat dry milk (Blotting Grade Blocker)  Biorad 170-6404
Human IgG  Sigma I 2511 HUMAN IgG purified Immunoglobulin, 5.6 mg/ml
Goat F(ab)2 antihuman IgG Fcγ (conjugated with peroxidase (PO)) Jackson ImmunoResearch 109-036-008
ELISA reader (Perkin Elmer 2030)  Perkin Elmer  2030-0050
Peroxidase-conjugated AffiniPure Rabbit Anti-Human IgM, Fc5µ  Jackson ImmunoResearch 309-035-095
SuperScript III Cells Direct cDNA Synthesis System  Invitrogen  18080-200
Applied Biosystems (ABI) GeneAm PCR System 2700 Applied Biosystems
High Pure RNA Isolation Kit  Roche 11828665001
Reverse transcription system kit  Promega A3500
Recombinant Taq DNA Polymerase TAKARA R001A
Primers (2μl) Sigma
Ultrapure Agarose  Invitrogen 16500-500
100 bp ladder Invitrogen 15628-019
Quantity One 4.5.2 (Gel Doc 2000) Biorad 170-8100
QIAquick PCR purification kit QIAGEN 28106
BigDye Terminator v3.1 cycle sequencing kit  Applied Biosystems 4337455
0.1 ml reaction plate (MicroAMP Optical 96-well) Applied Biosystems 4346906
Genetic analyser ABI300  Applied Biosystems 4346906
DH5α competent cells (E. coli) Invitrogen 18263-012
pFUSEss-CHIg-hG1 (4493 bp) Invivogen pfusess-hchg1
pFUSEss-CHIg-hG4 (4484 bp)  Invivogen pfusess-hchg4
pFUSE2ss-CLIg-hk (3875 bp) Invivogen pfuse2ss-hclk
pFUSE2ss-CLIg-hl2 (3883 bp)  Invivogen pfuse2ss-hcll2
SOC medium Invitrogen 15544-034
LB-based agar medium supplemented with Zeocin (Fast-Media Zeo Agar) Invivogen fas-zn-s
Terrific Broth (TB)-based liquid medium supplemented with Zeocin (Fast-Media Zeo TB) Invivogen fas-zn-l
DNA Miniprep kit  Omega Bio Technology D6942-02
Nanodrop (ND1000 Spectrophotometer) Nanodrop
LB-based agar medium supplemented with Blasticidin (Fast-Media Blast Agar) Invivogen fas-bl-s
Terrific Broth (TB)-based liquid medium supplemented with Blasticidin (Fast-Media Blast TB) Invivogen fas-bl-l
EcoRI New England Biolabs R0101S 20,000 U/ml, in 10x NEBuffer EcoRI
NheI New England Biolabs R0131S 10,000 U/ml, in 10x NEBuffer 2.1
2-Log DNA ladder New England Biolabs N3200S 0.1-10.0 kb, 1,000 μg/ml
XmaI New England Biolabs R0180S 10,000 U/ml, in 10x CutSmart Buffer 
BsiWI New England Biolabs R0553S 10,000 U/ml, in 10x NEBuffer 3.1
AvrII New England Biolabs R0174S 5,000 U/ml, in 10x CutSmart Buffer 
FastAP Thermosensitive Alkaline Phosphatase Thermo Scientific EF0651 1 U/µL, in 10x FastAP Buffer
DH5α competent cells  Invitrogen 18263-012
PE Mouse Anti-Human IgG BD Pharmingen 555787
anti-CD22, PerCP-Cy5.5, Clone: HIB22 Fisher scientific BDB563942
QIAprep Spin Miniprep Kit  QIAGEN 27106
BigDye Terminator v3.1 Applied Biosystems 4337455

References

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Cite This Article
Nogales-Gadea, G., Saxena, A., Hoffmann, C., Hounjet, J., Coenen, D., Molenaar, P., Losen, M., Martinez-Martinez, P. Generation of Recombinant Human IgG Monoclonal Antibodies from Immortalized Sorted B Cells. J. Vis. Exp. (100), e52830, doi:10.3791/52830 (2015).

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