During postnatal cerebellum development, immature granule cells originating from the germinal zone exhibit distinct modalities of migration to reach their final destination and to establish neuronal networks. This protocol describes the preparation of cerebellar slices and the confocal macroscopic approach used to investigate the factors that regulate neuronal migration.
출생 후 발달 동안, 미성숙 과립 세포 (흥분성의 interneurons)는 소뇌 피질의 내부 과립 층에 도달하는 분자 층과 조롱박 세포층에서 외부 과립 층 접선 이주하고 방사상 이동을 나타낸다. 이주 프로세스의 기본은 다양한 소뇌 기능에 적자로 이어지는, 세포 사멸 또는 뉴런의 오 배치를 유도한다. 구심력 과립 세포 이동은 최종 위치를 향해 안내하기 위해 세포의 화학 주성과 같은 세포 외 기질의 분해 등의 여러 메커니즘을 수반하지만, 각 층의 피질 세포의 이동을 조절하는 인자는 단지 부분적으로 알려져있다. 우리의 방법에있어서, 급성 소뇌 슬라이스는 P10 래트로부터 제조되며, 과립 세포를 형광 세포질 마커로 표지되고, 조직은 C 37 °에서 촛점 macroscopy하여 세포 이동의 실시간 모니터링을 시작하기 전에 4 내지 10 시간에 막 삽입에 배양 에서CO (2)의 존재. 소뇌의 다른 피질 층에서의 이송 중에, 과립 세포는 신경 세포의 이동의 조절에서의 가능한 역할을 조사하기 위해 신경 펩타이드 작용제 또는 길항제, 프로테아제 억제제, 세포 내 이펙터 또는 알코올이나 메틸 심지어 유해 물질의 차단제에 노출 될 수있다 .
현상 소뇌 뉴런의 8 개의 서로 다른 유형의 배아 둘째 주 및 설치류 1 초 출생 후의 주 간의 순차적 일어난다. 처음에 차 종자 영역에서 발생, 미성숙 과립 세포 (GC)는 외부 과립 층 (EGL), 차 종자 영역 2에서 생산되는 마지막 뉴런이다. 처음 세 출생 후의 주 동안, 소뇌 피질 EGL, 분자 층 (ML)을 포함하여 4 개의 계층으로 구성 잎 모양 구조, 조롱박 전지 층 (PCL) 및 내부 과립 층 (IGL) (도 1). 구심 마이그레이션, 미성숙 GC를, 글루타메이트의 interneurons을 통해 약 2 일 이내에 IGL에 도달합니다. 세 번째 출생 후 주까지, EGL가 사라지고 IGL은 성인 소뇌의 과립 층 (GL) 소위 구성한다. GL에서 GC를 이끼 섬유와 유니 폴라 브러시 세포에서 흥분성 시냅스 입력을 받고,골지체 세포로부터 축삭 억제 시냅스 입력한다. ML에서 GC의 축삭은 조롱박 세포, 바구니 세포, 성상 세포, 그리고 골지 셀이 포함 GABA 성 신경 세포와 흥분성 시냅스를 확인합니다.
초기 출생 후의 설치류에서 얻은 급성 소뇌 조각의 세포 운동의 실시간 관찰 GC를이 소뇌 피질 3에서의 경로 동안 이동의 양상과 속도의 변화와 병용 자신의 모양을 수정하는 것이 보여줍니다. 생후 첫 두 주 동안, GC 전구체 적극적 EGL 상단의 증식. EGL의 중간 부분에서, GC를 postmitotic는 큰 프로세스의 접선 방향으로 이동한다. EGL-ML 국경에서 GC를 자신의 움직임을 느리게, 세포는 ML에 짧은 수직 하강 프로세스를 입력하기 시작합니다. ML에서 GC를는 수직으로 연장 된 전지 본체, 얇은 후행 처리 및 더 방대한 선두 처리를 가지며, Bergmann은 아교 섬유의 반경 방향을 따라 이동한다. 에서PCL은 GC를 자신의 움직임을 중지하지만 장기간 고정 단계 (2 시간) 후, 그들은 PCL-IGL의 국경을 넘어. IGL에서 GC를 폐해는 섬유 지지체의 부재 층의 바닥을 향해 이동한다. 주요 프로세스의 팁되면 IGL 흰색 물질 (WM) 테두리, GC를 천천히 접근하고 그들의 움직임을 중지합니다. 시상 슬라이스는 ML, PCL 및 IGL에서 마이그레이션을 방사상에 전념하는 동안 소뇌의 가로 부분은 EGL에서 접선 마이그레이션 연구에 바람직하다. (예를 들어, 소마토스타틴은, PACAP)는 지금까지 확인 된 피질 신경 펩티드 있지만 각 층에서 GC 마이그레이션 시공간 제어에 관여하는 메커니즘을 포함한 전체 GC 운동의 일부 규제 요인은 여전히 알려져 있지 1,4,5,6-이다.
GC 마이그레이션 ACU에 대한 격리 된 배양 세포 또는 형광 검출 중 투과광 조명을 사용하여 비디오 카메라와 공 초점 현미경을 통해 지난 20 년 동안 연구되어왔다테 소뇌 조각. 처음 친 유성 DII, 그리고 최근 "셀 트래커"염료 및 세포 발현 단백질은 공 초점 형광 또는 이광자 현미경 -7,8- 사용 하였다. 성공적인 실험 프로토콜은 간단하지만 쉽지 않다 있도록 구체적인 절차의 수에 따라 달라집니다. 특히, 급성 슬라이스 수제 나일론 메쉬 네트워크 (9)와 함께 일반적으로 관측 동안에 안정해야한다. 광 조도는 다중 공 초점 현미경의 주사 방식 제안한 광독성 및 광표백을 피하기 위해 가능한 한 낮아야한다. 또한, 온도 및 CO 2는 신경 세포의 이동에 영향을 미칠 수있는 불안정 이후 주요 환경 매개 변수입니다. 촉진 및 실험 절차를 구체화하기 위해, 우리는, 조각의 움직임을 제한하는 일정한 환경 매개 변수를 보장 광표백을 감소시키고, consequ (milimeters의 순서에) 시야를 증가시키는 공 초점 macroscopy 프로토콜을 개발 한이미지 분석을 통해 추적 될 수있는 셀 (수십)의 수를 고한다면. 따라서, 180 μm의 두께 슬라이스 막 삽입에 배양하고 6- 웰 플레이트에 직접 큰 배양 챔버, 온도 및 CO 2 컨트롤러 및 진동 제어 시스템을 갖추고 상용 촛점 macroscope의 2X 전동식 대물하에 전사된다. 시간이 경과하고, Z 스택은 여러 시간 동안 약물 학적 도구를 수행하거나, 생체 활성 분자는 추가 또는 배양 배지 내에 전달 될 수있다. 이 방법은 또한 상이한 발달 단계에서 소뇌 또는 대뇌의 신경 세포의 다른 유형의 이동을 연구하기 위해 적응 될 수있다.
이 프로토콜은 트랜스 웰 시스템과 공 초점 macroscopy을 통해 출생 후 개발하는 동안 세포의 이동을 연구하는 녹색 형광 염료와 GC의 형광 표지 급성 P10 쥐 소뇌 조각의 문화를 설명합니다. 이 프로토콜은 12 시간 및 실험 기간 동안 작용제 또는 신경 펩타이드의 길항제, 효소 억제제, 세포 신호 변조기 또는 독성 물질을 포함한 이주 요인을 규제의 가능한 역할의 테스트까지의 기간에 대한 세포 이동을 관찰 할 수 있습니다. 피펫 팁과 막 삽입에 작은 구멍이 배양 배지에 화합물의 투여를 용이하게 할 필요가있다. 집에서 만든 곡선 피펫 팁은 용액의 전달을 용이하게하기 위해 사용될 수있다.
조직 조각을 생활에 세포 이동 연구의 한 가지 문제는 조직 자체의 운동 세포가 어려운 추적 할 수 있다는 것입니다. 이전의 접근법은 부드럽게 SLI 안정화 제안 반면나일론 CES 메쉬 또는 래트 꼬리 콜라겐 7,17의 얇은 층은이 기술의 주요 장점은 대물 하에서 CO 2 인큐베이터에서 막 삽입에 소뇌 슬라이스를 포함 6 웰 배양 플레이트의 단순하고 직접적인 전사이고 공 초점 macroscope의. 통합 온도와 CO 2 컨트롤러는 또한 세포 이동 (9)에 필수적인 적절하고 지속적인 환경 매개 변수를 제공합니다. 따라서, 배양 조건은 슬라이스 잘 멤브레인 삽입물에 부착되기 때문에 최소화된다 관찰 및 조직의 움직임 동안에 유지된다. 조직 안정화 취득 중에 참조를 고정해야 슬라이스 에지 또는 조롱박 세포의 위치에 따라 검증된다. 또한, 플레이트의 웰에 분포 6 소뇌 조각 (12 내지 18)는 신속 동력 스테이지 및 광학 줌을 상세히 관찰 할 수있다. 때문에 건조 목적, 에피의 큰 작동 거리 (X2, 39mm)에문화 매체가 훨씬 더 쉽습니다에서 – 전망대는 화합물의 침수 및 관리 무료입니다. 따라서, CO 2 배양기 및 공 초점의 환경 매개 변수 및 문화 지원 유사성은 생물학적 시료의 최대 보존으로 이어질 macroscopy.
프로토콜의 다른 장점은 큰 뷰의 필드를 동시에 관찰 할 수있다 셀 따라서 다수이다. 예를 들어, 우리는 이전에 ML에서 반경 이주 형광 GC를의 밀도가 1,124 ± 138 세포 / mm 2 18 것을 결정했다. 공 초점 macroscopy이 (X2는, NA는 0.234를 =) 공 초점 현미경에 비해 낮은 측면 해상도 (40X, NA = 1.25)하지만이 기술은 7,18 접근 사이에 세포 GC를의 몸은 쉽게 추적 할 수 및 마이그레이션의 평균 속도는 비슷 .
이미지 인수, 조직 슬라이스와 일의 질에 대한 기술 개선 게다가라벨의 전자 품질은 성공적인 실험을위한 키 포인트입니다. 항상 해부 과정에서 얼음에 미디어와 조직을 유지, vibratome 블레이드에 기름을 제거하고 접착제와 접촉 조직의 조각을 사용하지 않습니다. 시상 및 횡단면은 각각 방사형 및 접선 마이그레이션하도록되어있다. 소뇌의 다른 대뇌 피질의 층에 적절한 검출을위한 배양의 다른 길이를 사용합니다. (8 시간까지) 긴 배양 시간은 PCL과 IGL에 많은 GC를의 이동을 감지 할 필요합니다. GC 이주 특정 시공간 윈도우 동안 생리적 과정이기 때문에, 양성 대조군은 세포가 적절하게 이동해야한다는 것이다. 특히, ML 수많은 스핀들 GC는 시상 소뇌 슬라이스 주요 건강 지표 중 하나이다. 실험을 시작하기위한, ML에서 GC 운동의 관찰이 제안된다. 실제로, 수직으로 연장 된 전지 본체와 GC의 형상은 AC를 시작 기준점으로 간주되어야연속 제어 (2 시간)과 치료 (2 시간) ML 쉽게 수행 될 수있는 기간 quisition.
셀 추적기 가족이나 유전 적 구조를 통해 표현 형광 단백질과 같은 형광 염료는 세포 이동 연구에 추적자로 사용할 수 있습니다. 때문에 GC 마이그레이션 (1 스택 매 30 분)의 느린 반응 속도로, 여러 가지 빛깔의 실험은 또한 시스템에 4 레이저 빔 (405, 488, 532, 633 ㎚)부터 순차 모드에서 사용할 수있는 수행 할 수 있습니다. 기타의 interneurons의 추적, 구심력과 원심력 방사형 마이그레이션을 고려 또한 18 실현 될 수있다. 특히, 더 적은 다수의 세포 유형을보다 쉽게 넓은 시야와 로컬 라이즈 될 수있다. 마지막으로,이 프로토콜은 소뇌의 다른 개발 단계뿐만 아니라 다른 뇌 영역에서 세포 이동을 연구하는데 사용될 수있다.
The authors have nothing to disclose.
– (PeReNE, Interreg 4A ERDF)이 작품은 생물 의학의 연구 및 혁신 연구소 (IRIB), 노르망디의 세포 이미징 플랫폼 (PRIMACEN), INSERM, IBiSA, 루앙 대학교, 유럽 지역 개발 기금에 의해 지원되었다 LARC – 신경 과학 네트워크 및 지역 오트 노르망디.
Dulbecco’s modified eagle medium (DMEM) nutrient mixture F-12 | Sigma-Aldrich | D8437 | |
Hank's balanced salt solution 10X | Sigma-Aldrich | H1641 | |
PACAP38 | INRS, Canada | Bourgault et al., 200919 | |
PAI-1 | Calbiochem | 528208 | |
N-2 supplement | Fisher Scientific / Gibco/ invitrogen | O973 | |
cyanoacrylate glue | Loctite | ||
Cell Tracker Green CMFDA | Invitrogen | C2925 | |
Polyester Transwell-Clear inserts | Corning | 3452 | |
Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | |
6-well cell culture cluster | Corning | 3516 | |
DMSO | Fisher Scientific | BP231-100 | |
Tissue culture dish 35 mm diameter | BD Falcon | 353004 | |
Tissue culture dish 100 mm diameter | Thermo SCIENTIFIC | 130182 | |
Polypropylen tube (15 ml) | BD Falcon | 352096 | |
Ethanol 70% | Fisher Chemical | E/0800DF/21 | |
biological safety cabinet fume hood | Thermo Scientific | MSC9 Class II A2 | |
adjustable-volume pipette (0,5-10 µL) | Eppendorf | 4910 000.018 | |
gyro-rocker, SSL3 | Stuart | ||
CO2 incubator, Hera Cell 150 | Thermo Scientific | ||
vibrating blade microtome, VT1000S | Leica Microsystems | ||
confocal macroscope, TCS LSI | Leica Microsystems | ||
temperature controller | PeCon | ||
CO2-controller | PeCon | ||
Stereomicroscope, M205 C | Leica Microsystems | ||
Operating scissors, curved, blunt/blunt | Medicon | 03.03.17 | |
Hardened fine iris scissors, straight, sharp/sharp | FST | 149090-11 | |
Dumont #3 and #5 forceps | FST | 11293-00 and 11252-20 | |
Vibratome injector blades/single edge | Leica Microsystems | 39053250 | |
standard scalpel handle #3 solid | FST | 10003-12 | |
surgical blade #15 | Swann-Morton | 205 |