Here, we present a protocol for direct stereotaxic brain infusion of amyloid-beta. This methodology provides an alternative in vivo mouse model to address the short-term effects of amyloid-beta on brain neurons.
Болезнь Альцгеймера является нейродегенеративных заболевание, поражающее старения населения. Ключ невропатологических признаком болезни является чрезмерно производство бета-амилоида и отложение бета-амилоида бляшек в мозге регионах пострадавших лиц. На протяжении многих лет ученые генерируется многочисленные модели болезни Альцгеймера мыши заболевание, которые пытаются повторить бета-амилоида патологии. К сожалению, мышиные модели только выборочно имитировать функции болезни. Гибель нейронов, выраженный эффект в мозге пациентов с болезнью Альцгеймера, заметно не хватает в этих мышей. Следовательно, мы и другие использовали метод непосредственно вливая растворимые олигомерные видов бета-амилоида – формы бета-амилоида, которые были доказаны, чтобы быть наиболее токсичным для нейронов – стереотаксически в мозг. В этом докладе мы используем мужчин C57BL / 6J к документу это хирургическая методика увеличения бета-амилоида уровней в избранной области мозга.Вливание цель зубчатой извилине гиппокампа, поскольку эта структура мозга, а также в базальных отделах переднего мозга, который соединен с холинергической цепи, представляет собой одну из областей дегенерации в болезни. Результаты повышения амилоида-бета в зубчатой извилине через стереотаксической инфузии выявить увеличение потерь нейронов в зубчатой извилине в течение 1 недели, в то время как есть сопутствующее увеличение гибели клеток и потере нейронов холинергической в вертикальном конечности диагональной полосы Брока в базальных отделах переднего мозга. Эти эффекты наблюдаются до 2 недель. Наши данные показывают, что нынешний настой модель амилоида-бета обеспечивает альтернативную модель мыши для решения конкретной региона гибель нейронов в краткосрочной перспективе. Преимущество этой модели является то, что амилоид-бета может быть повышен в пространственной и временной основе.
Амилоида бляшек депозиты, которые состоят из бета-амилоида (Ар 1-42), являются ключевой особенностью патологии болезни Альцгеймера (AD). Многочисленные исследования показали, что высокие уровни токсичных или рекомбинантных олигомерные Ар 1-42 вызывают гибель нейронов, синаптическую дистрофия, потеря и дисфункции; а также обучения и памяти дефицита 1-4. Мозговые регионы, пострадавшие включают гиппокамп, кору, подкорковые структуры и такие, как базальных отделах переднего мозга и миндалины 5,6. На сегодняшний день существует несколько трансгенных моделей мыши, которые пытаются имитировать Ар 1-42 патологии эры. В зависимости от штамма эти животные оказаться полезным при рассмотрении выберите патологические особенности AD. К сожалению, за исключением 2 трансгенных линий, APP23 и 5XFAD, эти мыши не полностью повторить потерю нейронов, ключевой аспект нашей эры. Даже с потерей нервных наблюдается в APP23 и 5XFAD, гибель нейронов obserВЭД был тонкий, возраст зависит и изолированные на несколько отдельных регионах 7,8.
Прямое впрыскивание олигомерного Ар 1-42 в дикого типа мозга мыши обеспечивает превосходное в естественных условиях модели, которая повторяет гибель нейронов аспект amyloidopathy 1,9,10. В отличие от обычно используемых трансгенных мышах олигомерные Ар 1-42 настой модель идеально подходит для остро повышения Ар 1-42 уровней в пространственном и временном порядке. Преимущество использования мышей дикого типа для этой модели устраняет потенциальные компенсационные или побочные эффекты от мутаций, введенных в трансгенных линий мышей. Проведенные исследования показали, что вливание токсические уровни Ар 1-42 в гиппокампе вызывает гибель нейронов в непосредственной близости от места инъекции в течение 1 недели 1. Кроме того, в соответствии с наблюдением, что Ар 1-42 является токсичным для холинергических нейронов базального 11 переднего мозгахолинергические нейроны (BFCN) населения, который выступает в гиппокампе уменьшается на 20-50% в течение 7-14 дней после бета-амилоида инфузии 1,10 у мышей, позволяющий эффективно для экзаменов изолированной нейронной цепи в мозге. Так проекта BFCN ипсилатерально к зубчатой извилине гиппокампа 12, по большей части управления / автомобиля и олигомерных Ар 1-42 решения могут быть введены по обе стороны мозга, позволяющей проводить сравнения между левым и правым полушариями 1.
В этом докладе мы будем предоставлять подробную хирургического и инъекции методологии взрослых дикого типа C57BL / 6J. Этот штамм мыши выбрана потому, что его широкого использования в научных исследованиях. Технически, любая область мозга могут быть направлены для инфузий, однако здесь мы будем использовать зубчатой извилине гиппокампа в качестве цели для иллюстрации технику.
Для достижения успешного Ар 1-42 инъекции экспериментатор или хирург обязан: 1) использовать асептики; 2) правильно определить область мозга, интерес с точными координатами; 3) уметь правильно закрепить мышь в стереотаксической рамы с мозгом сравняли в АР оси и ML; 4) иметь возможность …
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана Национальным институтом неврологических расстройств и инсульта предоставить NS081333 (для CMT), Альцгеймера грант Ассоциация NIRG-10-171721 и Национальный институт психического здоровья грантов MH096702 (для UH) и Национальный институт по проблемам старения, финансируемых исследований болезни Альцгеймера Центр Колумбийского университета пилот гранта AG008702 (в YYJ и JB).
Ketamine HCl (100mg/ml) | Henry Schein Medical | 1049007 | 100 mg ketamine per 1 kg animal |
Xylazine (20mg/ml) | Henry Schein Medical | not available | 10 mg xylazine per 1 kg animal |
Buprenex (0.3mg/ml) | Henry Schein Medical | 1217793 | 0.1 mg buprenex per 1 kg animal |
Aβ1-42 | David Teplow/UCLA | not available | 100 μM; This amyloid was used in the paper |
Aβ1-42 | Bachem | H-1368 | Can be used in place of amyloid from the Teplow lab |
Aβ1-42 | American Peptide | 62-0-80B | Can be used in place of amyloid from the Teplow lab |
Scrambled Aβ1-42 | American Peptide | 62-0-46B | Can be used as control peptide for comparing Aβ1-42 |
NU4 Antibody (Oligomeric Amyloid Antibody) | Gift from William Klein/Northwestern U. | not available | 1:2000 dilution |
Anti-Amyloid Oligomeric Antibody (Polyclonal Rabbit) | EMD Millipore | AB9234 | May be used in place of Nu4; needs to be tested by the end user |
6E10 Antibody (Monoclonal Mouse) (Amyloid Antibody) | Biolegend | sig-39320 | 1:1000 dilution |
ChAT Antibody (Polyclonal Goat) | Millipore | AB144P | 1:100 dilution |
DeadEnd Fluorometric TUNEL system | Promega | G3250 | Follow manufacturer's directions for use |
Prolong Gold Antifade Reagent with DAPI | Invitrogen | P36935 | Use when coverslipping slides |
Fluorogold | Fluorochrome, LLC | not available | 2% solution |
Absolute Ethanol (200 proof) | Fisher Scientific | BP2818-4 | For making 70% ethanol for sanitizing and disinfecting |
Novex 10-20% Tricine gel | Life Technologies | EC6625BOX | For separating Aβ1-42 |
Novex Tricine SDS Running Buffer (10X) | Life Technologies | LC1675 | For running 10-20% Tricine gels |
Novex Tris-Glycine Transfer Buffer (25X) | Life Technologies | LC3675 | For transferring 10-20% Tricine gels |
SuperSignal Western Blot Enhancer | Thermo Scientific | 46640 | For enhancing Aβ1-42 signal; follow manufacturer's protocol |
Protran BA79 Nitrocellulose Blotting Membrane, 0.1 μm | GE Healthcare Life Sciences | 10402088 | For transferring 10-20% Tricine gels |
Xcell SureLock Mini-Cell | Life Technologies | EI0001 | Electrophoresis aparatus for running 10-20% Tricine gels |
GenTeal Lubricant Eye Gel | Novartis | not available | For keeping the mouse eyes moist during surgery; can be found in local pharmacy stores |
Refresh Optive Lubricant Eye Drops | Allergan | not available | For keeping the mouse eyes moist during surgery; can be found in local pharmacy stores; Can be used in place of GenTeal |
Betadine | Stoelting | 50998 | For sanitizing and disinfecting |
Round/Tapered Spatula | VWR | 82027-490 | For opening animal mouth |
Bulldog Serrefines Clamps (Jaw Dims. 9X1.6mm; Length 28mm) | Fine Science Tools | 18050-28 | Optional; For keeping scalp skin apart during injection |
Straight Fine Scissors (Cutting edge 25mm; Length 11.5cm) | Fine Science Tools | 14060-11 | For cutting scalp |
#3 Scalpel Handle | Fine Science Tools | 10003-12 | |
#11 Surgical Blade | Fine Science Tools | 10011-00 | For making scalp incision |
Student Standard Pattern Forcep (Tip Dims. 2.5×1.5mm; Length 11.5cm) | Fine Science Tools | 91100-12 | For holding scalp closed during suturing |
Trimmer Combo Kit | Kent Scientific | CL9990-1201 | For shaving hair |
T/Pump Warm Water Recirculator | Kent Scientific | TP-700 | For warming animal during surgery |
Resusable Warmining Pad (5" x 10") | Kent Scientific | TPZ-0510FEA | For attaching it to the T/Pump warm water recirculator to warm the animal during surgery |
Cordless Micro Drill | Stoelting | 58610 | Use 0.8mm steel burrs to drill holes in the skull |
Lab Standard Stereotaxic Instrument with Mouse & Neonatal Rat Adaptor | Stoelting | 51615 | |
Just for Mouse Stereotaxic Instrument | Stoelting | 51730 | Can use this in place of Stoelting Cat. #51615 |
Quintessential Stereotaxic Injector | Stoelting | 53311 | |
Dry Glass Bead Sterilizer | Stoelting | 50287 | For sterilizing stainless steel instruments |
Sterile Surgical Drape (18" x 26") | Stoelting | 50981 | |
Hamilton Syringe 50 ml, Model 705 RN SYR, NDL | Hamilton Company | 7637-01 | For brain injection; use different syringes for different solutions |
29 Gauge Needle, Small Hub RN NDL | Hamilton Company | 7803-06 | For attaching to the Hamilton syringe for brain injection |
1 ml BD Tuberculin Syringes | VWR | BD309659 | For administering anesthesia and saline |
30 Gauge Needle (0.5") | VWR | BD305106 | For administering anesthesia and saline |
Portable Electronic CS Series Scale (Ohaus) | VWR | 65500-202 | For weighing animals to determine anesthesia dose |
Hot plate (Top Plate Dims. 7.25×7.25in) | VWR | 47751-148 | For warming animals post-surgery |
Sofsilk Silk Suture C-1 Cutting 3/8, 12 mm | Covidien | S1173 | For closing wound |
Vetbond Tissue Adhesive (3M) | Santa Cruz Biotechnology | sc-361931 | Optional: for aiding in wound closure; Use with suture. |
Cotton-Tipped Wooden-Shaft Sterile Applicators | Fisher scientific | 22-029-488 | For cleaning and drying surgical wound |
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | For collecting brain sections |
VWR Micro Cover Glass 24 X 50 mm | VWR | 48393241 | For mounting microscope slides |
Thermo Scientific Nalgene Syringe Filter 0.2 μm | Fisher Scientific | 194-2520 | For sterilizing saline solution |
Sterile dual tip skin markers by Viscot Medical | Medline | VIS1422SRL91 | For marking coordinates on the skull |