Intranasale toediening van recombinante Influenza Vaccines in Chimerisch muismodellen om mucosale immuniteit bestuderen
Summary
There is an overall lack of knowledge about how vaccines work. Here we propose the combined use of reverse genetics and bone marrow chimeric mice to gain insight into the early host immune responses to vaccines with a special focus on dendritic cells and T cell immunity.
Abstract
Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the physiological mechanisms that mediate immune responses to vaccines perhaps due to the overall success of vaccination, which has reduced interest into the molecular and physiological mechanisms of vaccine immunity. However, several important human pathogens including influenza virus still pose a challenge for vaccination, and may benefit from immune-based strategies.
Although influenza reverse genetics has been successfully applied to the generation of live-attenuated influenza vaccines (LAIVs), the addition of molecular tools in vaccine preparations such as tracer components to follow up the kinetics of vaccination in vivo, has not been addressed. In addition, the recent generation of mouse models that allow specific depletion of leukocytes during kinetic studies has opened a window of opportunity to understand the basic immune mechanisms underlying vaccine-elicited protection. Here, we describe how the combination of reverse genetics and chimeric mouse models may help to provide new insights into how vaccines work at physiological and molecular levels, using as example a recombinant, cold-adapted, live-attenuated influenza vaccine (LAIV). We utilized laboratory-generated LAIVs harboring cell tracers as well as competitive bone marrow chimeras (BMCs) to determine the early kinetics of vaccine immunity and the main physiological mechanisms responsible for the initiation of vaccine-specific adaptive immunity. In addition, we show how this technique may facilitate gene function studies in single animals during immune responses to vaccines. We propose that this technique can be applied to improve current prophylactic strategies against pathogens for which urgent medical countermeasures are needed, for example influenza, HIV, Plasmodium, and hemorrhagic fever viruses such as Ebola virus.
Introduction
Het genereren van immunologische geheugen in de afwezigheid van ziekte is de fysiologische basis van efficiënte vaccinatie 1. Onlangs zijn systemen-biologie gebaseerde benaderingen bleek dat succesvolle vaccins zoals gele koorts vaccin, induceert een sterke inductie van de aangeboren immuunrespons en activatie van verschillende subsets van dendritische cellen (DCs), die op hun beurt leiden tot activatie van antigeen multilineage specifieke T-cellen 2,3. Aangezien DCs de enige immuuncel populatie met de mogelijkheid om antigenspecifieke naïeve T-cellen activeren 4, de studie van hun functie tijdens de vaccinatie essentieel voor de immuunrespons op vaccins begrijpen en toekomstige strategieën te ontwikkelen tegen pathogenen uitdagend.
Een systeem dat opsporing van verschillende DC subsets tijdens de immuunrespons op vaccins zou wenselijk zijn om een nauwkeurige kinetiek van DC migratie naar lymfoïde weefsel vast te stellen en derhalve te voorzieninzicht in de fysiologische mechanismen die verantwoordelijk zijn voor de initiatie van de vaccin-specifieke adaptieve immuniteit. Reverse genetica gebaseerde aanpak bieden de mogelijkheid genereren gemodificeerd levend-verzwakte vaccins die experimenteel kan worden met dit doel. Sinds de uitvoering ervan op influenza onderzoek, heeft-plasmide gebaseerde reverse genetics op grote schaal toegepast om recombinante influenzastammen inclusief LAIVs genereren. Standaardprotocollen te redden recombinante influenzavirussen vereist multi-transfectie van sterk transfectable cellijnen ambisense plasmiden (die zowel positieve als negatieve sense RNA) die de acht segmenten van influenza virus en amplificatie in een tolerante systeem zoals Madin-Darby Canine Kidney ( MDCK) cellen en / of geëmbryoneerde kippeneieren 5. De toepassing van reverse genetica moleculaire technieken genereren om de immune mechanismen van vaccinatiestudie blijft onontdekt.
The generationvan nieuwe muismodellen waardoor specifieke uitputting van immuuncelsubklassen, inclusief DC, heeft geopend nieuwe mogelijkheden om de fundamentele immuun onderliggende mechanismen-vaccin ontlokte bescherming begrijpen. De vergelijking tussen DC subgroep functies in muis en mens is gebleken dat, voor een groot deel, muis en humane DCs functioneel homoloog 6,7 Deze bevindingen suggereren sterk dat de ontwikkeling van muismodellen om specifieke depletie van DCs in de steady state en bij ontstekingsaandoeningen, kan dienen om de fysiologie van DC responsen in mensen begrijpen. In de afgelopen jaren een aantal muismodellen zijn gegenereerd dragende transgenen tot expressie het simian difterietoxine (DT) receptor (DTR) onder de controle van het promotorgebied van een gen van interesse 8,9. Sinds muisweefsels nature niet uitdrukken DTR, deze modellen maken voorwaardelijke uitputting van de cel subsets die het doelwit gen van belang bij de muis inenting met DT. Aldus onze ability specifieke DCs en andere leukocyten in vivo afbreken tijdens fysiologische processen, is sterk verbeterd door de ontwikkeling van DTR-gebaseerde ro. Hoewel transgene muismodellen zijn uitgebreid toegepast om de ontogenie van het immuunsysteem begrijpen ervan op vaccinontwikkeling is nauwelijks onderzocht. Hier, door het combineren van influenza reverse genetics en DTR-gebaseerde competitieve beenmerg chimeren, stellen we een methode om de kinetiek van vaccinimmuniteit evenals individuele bestudering van genfunctie tijdens de immuunrespons op vaccins in vivo. De toepassing van deze technologie voor preklinische evaluatie van nieuwe vaccins tegen uitdagende infectieziekten kan bijdragen tot vaccinontwerp rationaliseren en vaccin gegadigden in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
In deze studie beschrijven we hoe reverse genetics chimerische muismodellen kan worden gebruikt om de fysiologische en moleculaire mechanismen van door vaccin geïnduceerde immuniteit te helderen. Influenza reverse genetics is opgericht in veel laboratoria en heeft een hoofdrol in het begrijpen van influenza pathogenese, replicatie en transmissie 17 gespeeld. Een belangrijk punt in ons protocol is redding van koude aangepaste influenzavaccins uiting buitenlandse epitopen. Hoewel de strategie van integratie va…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Sergio Gómez-Medina for excellent technical support with mouse experiments. This work was supported by funds from the Leibniz Association and the Leibniz Center of Infection. A.L. is a recipient of a pre-doctoral fellowship from the Leibniz Graduate School.
Materials
| Dulbecco´s Modified Eagle Medium (DMEM 1X) | Gibco RL-Life Technologies | 41965-039 | |
| Opti MEM | Gibco RL-Life Technologies | 31985-047 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen-Life Technologies | 11668-027 | |
| Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml) | PAA | p11-010 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Embryonated eggs | Valo biomedia Gmbh | ||
| PBS (1X) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| 70 μM Nylon Filters | Greiner-Biorad | 542-070 | |
| Red Blood Cell Lysing buffer (RBCL) 10X | BD Bioscience | 555899 | |
| CD16/CD32 Mouse BD Fc Block (2.4G2) | BD Pharmigen | 553142 | |
| APC-Anti-mouse SIINFEKL-H2kb (25 D1.16) | Biolegend | 141605 | |
| PE-Anti-mouse CD11c (HLA3) | BD Biosciences | 553802 | |
| eFluor 450-Anti-mouse MHCII (Md/114.15.2) | eBioscience | 48-5321-82 | |
| Pe-Cy7-Anti-mouse CD11b (M1/70) | Biolegend | 101216 | |
| PerCp/Cy5.5-Anti-mouse CD103 (2E7) | Biolegend | 121416 | |
| PE-Anti-mouse CD45.1 (A20) | eBioscience | 12-0453-82 | |
| V500-Anti-mouse CD45.2 (1O4) | BD Bioscience | 562130 | |
| PerCp-eFluor710 -Anti-mouse CD8a (53-6.7) | eBioscience | 46-0081-80 | |
| APC-Cy7-Anti-mouse CD3ε (145-2611) | Biolegend | 100325 | |
| eFluor450-Anti-mouse CD4 (GK 1.5) | eBioscience | 48-0041-80 | |
| CFSE Proliferation dye | eBioscience | 65-0850-85 | |
| Baytril 2.5% | Bayer | 65-0850-85 | |
| Dymethil-Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Ovalbumin | Molecular probes | O23020 | |
| Diphteria Toxin (DT) | Sigma-Aldrich | D0564 | |
| Trypsin-TPCK | Sigma-Aldrich | T1426 | |
| BD FACsCanto II Flow cytometer | BD Biosciences | ||
| FlowJo cell analysis software 9.5 | Flowjo inc. | ||
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Life technologies | T10282 | |
| Countess Automatic Cell Counter | Invitrogen-Life Technologies | C10227 |
References
- Bevan, M. J. Understand memory, design better vaccines. Nat. Immunol. 12, 463-465 (2011).
- Gaucher, D. Yellow fever vaccine induces integrated multilineage and polyfunctional immune responses. J. Exp. Med. 205, 3119-3131 (2008).
- Querec, T. D. Systems biology approach predicts immunogenicity of the yellow fever vaccine in humans. Nat. Immunol. 10, 116-125 (2009).
- Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392, 245-252 (1998).
- Martínez-Sobrido, L., García-Sastre, A. Generation of recombinant influenza virus from plasmid DNA. J Vis Exp. 3, (2010).
- Haniffa, M. Human Tissues Contain CD141hi Cross-Presenting Dendritic Cells with Functional Homology to Mouse CD103+ Nonlymphoid Dendritic Cells. Immunity. 37, 60-73 (2012).
- Haniffa, M., Collin, M., Ginhoux, F. Ontogeny and functional specialization of dendritic cells in human and mouse. Adv. Immunol. 120, 1-49 (2013).
- Jung, S. In vivo depletion of CD11c+ dendritic cells abrogates priming of CD8+ T cells by exogenous cell-associated antigens. Immunity. 17, 211-220 (2011).
- Lahl, K., Sparwasser, T. In vivo depletion of FoxP3+ Tregs using the DEREG mouse model. Methods Mol. Biol. 17, 211-220 (2011).
- Duffield, J. S. Selective depletion of macrophages reveals distinct, opposing roles during liver injury and repair. J. Clin. Invest. 115, 56-65 (2005).
- Meredith, M. M. Expression of the zinc finger transcription factor zDC. J. Exp. Med. 209, 1153-1165 (2012).
- Girón, J. V. Mucosal Polyinosinic-Polycytidylic Acid Improves Protection Elicited by Replicating Influenza Vaccines via Enhanced Dendritic Cell Function and T Cell Immunity. J. Immunol. 193, 1324-1332 (2014).
- Freshney, R. I. Culture of animal cells: a manual of basic technique. bib.usb.ve. , (1983).
- Cox, R. J., Brokstad, K. A., Ogra, P. Influenza virus: immunity and vaccination strategies. Comparison of the immune response to inactivated and live, attenuated influenza vaccines. Scand. J. Immunol. 59, 1-15 (2004).
- Gowdy, K. M. Impaired CD8(+) T cell immunity after allogeneic bone marrow transplantation leads to persistent and severe respiratory viral infection. Transpl. Immunol. 32, 51-60 (2015).
