Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.
膵管腺癌(PDAC)は、放射性および化学療法に対する腫瘍の開始、転移および抵抗を駆動することが示されている排他的に腫瘍形成性癌幹細胞(CSCを)のサブセットが含まれています。ここでは、足場非依存性の条件で腫瘍球のような主要なヒト膵臓のCSCを培養するための具体的な方法論を説明します。細胞は、それらのより分化した子孫が生存し、単一の細胞の播種以下の初期段階の間に増殖しないながらのCSCを濃縮するために、無血清、非付着条件下で増殖させます。このアッセイは、腫瘍細胞の集団に存在するのCSCの割合を推定することができます。 (35から250マイクロメートルの範囲とすることができる)サイズと形成された腫瘍球の数の両方が培養された癌細胞または新たに採取し、消化された腫瘍1,2のバルク集団のいずれかに抱いCSC活動を表します。このアッセイを使用して、我々は最近、メトホルミンが選択pancreatを切除することがわかりましたICのCSC;その後、さらに多能性関連遺伝子/表面マーカーの発現が減少を示すことによって裏付けとメトホルミンで処理した細胞の生体内腫瘍形成性に減少した発見。前臨床開発のための最後のステップとして、我々は、メトホルミンとの確立した腫瘍を有するマウスを処置し、大幅に生存期間の延長を発見しました。 PDACを有する患者において、メトホルミンの使用をテストする臨床試験が現在進行中である( 例えば、NCT01210911、NCT01167738、およびNCT01488552)。機構的に、我々は、メトホルミンは、反応性酸素種(ROS)の産生を増強し、ミトコンドリアの膜電位を低下させることによってのCSCにおける致命的なエネルギー危機を誘発することがわかりました。対照的に、非のCSCは、メトホルミン治療によって排除ではなく、可逆的な細胞周期の停止を受けていませんでした。したがって、我々の研究は、潜在的にCSCを標的とする化合物を同定するためのスクリーニングツールとしてインビトロ球形成の可能性のための成功例として機能しますsが、この技術は、偽発見を排除するために、in vitroおよびin vivoの検証にさらに必要となります。
膵管腺癌(PDAC)は最も積極的な固形腫瘍の一つです。これは、現在西洋社会における4 番目の最も一般的な癌関連死であると(〜全世界で年間40万人が死亡)、次の10年以内に2 番目の最も多い原因に存在する患者の診断、90%の3 .AT時間を増加すると予測されています5%未満の5年生存率を有する進行性疾患を有します。この生存率はがっかりするほど、ますます集中的な研究活動にもかかわらず、4、過去50年間で変化していません。外科的切除を介して潜在的に「硬化性」病を有する患者の残りの10%のうち、80%は5年以内に再発から死亡します。長年の間、進行した疾患のためのケアの標準は、ゲムシタビン単独療法となっているが、これはわずかしか生存優位5を付与する。添加することによって達成されている短期生存率の小さな改善エルロチニブ6またはカペシタビン7の、しかし生存利益は、全生存期間の中央値はまだ〜6ヶ月に数週間程度です。最近では、より多くの有望な結果は、ゲムシタビン/ NAB -パクリタキセル8とFOLFIRINOXの組み合わせ政権9,10のために浮上しています。これらの治療はそれぞれ控えめ2と4ヶ月の生存期間中央値は改善されますが、非常に毒性と長期生存者はまだまれな例外されています。治療は改善の可能性を提供していますが、これらは多くの患者が応答のみ、全体的な生存率の漸進的な改善を示していないために有毒な制度です。その結果、現在の治療法を補完すると、新規な、最も可能性の高いマルチモーダル治療アプローチを開発することが急務です。
腫瘍の不均一性
これは、癌の不均一のみの異なる進化のサブクローンのwithiに限定されないことがますます明らかになってきていますnは各腫瘍11だけでなく、各サブクローン12内の表現型および機能的不均一性および可塑性によって駆動されます。いわゆる癌幹細胞(CSCの)または腫瘍促進細胞はクローン内の異質13-16を担当しています。具体的には、CSCが、彼 らはそれぞれの癌サブクローン17内のすべての分化子孫を生じさせることにより、疾患のルートを表していることを、私たちと他の人が単一のセルに至るまで、決定的な証拠を提供しているために、癌細胞のサブセットを表します。さらに重要なことは、これらの細胞が転移挙動のために不可欠であり、またしても初期の腫瘍退縮( 例えば、NAB -パクリタキセル)15,18-20を誘導することができる、比較的効果的な薬で、治療後の疾患再発のための重要な供給源を表します。これは、CSCを、必ずしも善意の幹細胞を表すものではありません、また、彼らは多くの場合、組織幹細胞から生じるないことに留意することが重要であるが、むしろ彼らが持っているACQ幹細胞の特定の機能をuired。これらのほとんどは、機能的に定義されている、例えばCSCが無期限の自己再生能力は、従来の化学療法にそれらを耐性作りを装備し、転移活性を促進増加侵襲性を示しています。
機能性がん幹細胞の表現型
のCSCの機能的表現型を、それぞれシリアル球形成及びコロニー形成アッセイを用いてインビトロで試験することができる自己再生する能力に基づいています。さらに重要なこと、好ましくは排他的な長期的な腫瘍形成性を示す連続移植の際に、究極の機能読み出しとしてin vivoアッセイ希釈を制限することによってテストすることができ、インビボ腫瘍形成能で自己再生クマが可能なのCSC。また、CSCの区画内の不均一性がないだけで、その転移を生じる排他的な能力を有するのCSCの異なる亜集団であり、インビボ腫瘍形成能での排他の直接の結果。実際、metastastiticのCSCは、原発腫瘍を回避アノイキスを生き残るためには、最終的に移行してセカンダリサイトをシードする能力を獲得します。これらの高度な機能的能力を改変浸潤アッセイを用いてインビトロで試験し、 インビボでの転移アッセイを使用することができます。
癌幹細胞を標的
CSC-ターゲティング戦略21と組み合わせない限り、私たちと他の人は治療があっても、間質ターゲティング剤と組み合わせて、分化したPDAC細胞のバルク腫瘍に焦点を当てていることを説得力のある証拠を提供した、腫瘍の進行およびその後の結果に大きな影響を持っていません、 22。このように、疾患の進行および治療 に対する抵抗のCSCをの重要な機能に基づいて、これらの細胞は、任意の新たな治療法18,20のための必須の成分を意味する必要がありますが、Oはるかに十分な理解が必要になりますのCSCの調節機構F。 CSCおよびそれらのより分化した子孫が遺伝的変化に対して同一の遺伝的基底状態を負担するが、CSCが明確なので、後成的に決定された遺伝子発現は、多能性幹細胞とその共有モジュールをプロファイル示します。生成誘導多能性幹細胞(Nanogの、のOct3 / 4、Klf4の、Sox2の)に関与する遺伝子の大部分は、癌に関連していないが、その発現はほとんどのCSCの区画に制限されています。また、CSCををターゲットにするための遺伝子ツールを使用して、機能喪失実験によるのCSCの機能的関連性は今しっかりと、いくつかの癌タイプ23-25 用CSCの概念を確立しています。これらのアプローチの多くはマウスモデルに基づいて容易にクリニックに譲渡されていないが、それらは、バルク腫瘍細胞との組み合わせでのCSCを標的とする潜在的な臨床的関連のための概念実証を提供しません。
VIにがん幹細胞の研究彼らのアキレス腱を識別するために、TRO
のCSCを標的とする新規かつ臨床的に適用可能な方法を識別するために、それらの特徴は、定期的に、インビトロで研究され、球体形成が広く、この文脈で使用されます。もともと自己再生および分化能を含む正常な幹細胞生物学を研究するために開発され、このアッセイは後にin vitroでのCSCを研究するために適合され、PDAC 20から単離したCSCを調査するために使用されています。したがって、我々は、彼らが善意の膵臓のCSC 21を含んで示す、一次ヒトPDAC細胞から形成された腫瘍球がのCSCのすべての明確な特徴を負担することを見出しました。したがって、腫瘍球アッセイは、 インビトロでより効果的な治療法をスクリーニングするための強力なツールを表すが、結果は、in vivoアッセイにおいて 、より厳格に評価する必要があります。実際、このin vitroアッセイで生成されたデータは、目として大きな慎重に扱われるべきですEアッセイは、大きな誤差を受けることができます。形成された球体の自動化された計数を含む高度に標準化されたプロトコルは、再現性と予測データを確実にするために確立されるべきです。
この文脈において、我々は最近、初代ヒトのPDACの多様なセットから誘導される膵臓のCSCをスクリーニングするために、このアッセイを使用し、これらの細胞は抗糖尿病化合物のメトホルミンによる代謝再プログラミングに対して非常に脆弱であることを示しました。以前は、メトホルミンがAMP活性化プロテインキナーゼ(AMPK)シグナリングおよび還元タンパク質合成および細胞増殖の27が得られたmTOR 26のその後の阻害の間接的な活性化による癌細胞の増殖を阻害することが実証されました。バルク腫瘍集団に対するこれらの効果に加えて、その他はメトホルミンを標的とし、実際、乳癌、食道癌、膠芽細胞腫及び膵臓癌28-31 <として固形腫瘍の数のCSCの亜集団を排除することができることを発見しました/ SUP>。このように、メトホルミンは、現在満たされていない医療ニーズを持ついくつかの癌のための有望な、安全な新しい治療戦略を表しています。また、CSCを濃縮するために方法として、球体の形成を使用して、我々は、膵臓のCSCのメトホルミンの主な効果はAMPK活性化とは無関係に、ほとんど明らかにサブセットに対して致死であった、(複合体Iの阻害を介して)、そのささやかなミトコンドリア毒性に依存していたことを示しましたのCSCだけ。後者のために、我々は、細胞レベルでの薬物の毒性の指標としてそれらの細胞の酸素消費量とミトコンドリアROS産生を評価することができました。続いて、これらのインビトロのデータは、前臨床マウスモデルにおいて検証し、実際に大幅に生存期間の延長31をもたらした可能性があります。本明細書に提示する方法は、CSC代謝に及ぼす影響についての研究を含めたCSCのための薬剤感受性プロファイルの迅速な生成を可能にします。現在、利用コムについて拡張実験の詳細を提供しますin vitroおよびin vivoの手順で plementary。
多くの腫瘍のためのCSCの概念の出現とその後の検証では、薬剤開発の分野では、より効率的ながん治療法を開発し、その後、疾患の再発のリスクを低減するための可能性を有する、新たな勢いを得ています。しかし、CSCのフィールドは、CSCの起源と伝播し、腫瘍構造を形成および転移を促進する上で自分の役割を理解するという点で達成されるべき初期の状態、よりニーズにとどまっています。
この文脈において、再現性と意味のあるCSCアッセイの使用だけでなく、得られたデータの情報に基づいた解釈は、CSC生物学の我々の理解を進めるための重要なコンポーネントを表します。多くの生物学的観点から、球の形成は非常に貴重なアッセイとして浮上しています。それにもかかわらず、ユーザーが適切に実験結果を解釈するためにその限界を認識する必要があります。でも球フォーマの評価の前に考慮すべき重要な側面るデータは、新鮮な患者由来の試料から得られた結果は、確立された癌細胞株から得られたものとは大きく異なる可能性があるので、調査サンプルの起源です。
古典的な球体形成アッセイは、21超低付着プレートにクローン密度で細胞を播種し、上皮成長因子(EGF)および/ または塩基性線維芽細胞増殖因子(b-FGF)の存在下で、球体形成を評価する富むが、無血清培地含みます34。培地組成物は、考慮すべき重要な課題です。我々の経験では、血清の非存在下でB27、bFGFおよびグルタミンを補充したDMEM / F12は、未分化状態でCSCを、成長拡大し、維持するために最適な媒体であることがわかりました。私たちは、CK(この培養条件(培地、懸濁液)で細胞が(CD133 +、CD44 +およびCD24 +を含む)がん幹細胞マーカーを大量に発現し、分化関連タンパク質を発現しないことがわかりました-20及びCK-19)。
これらのアッセイのための基本的な前提条件の一つは、各球がクローンであることである、 すなわち、1つの球は、単一の幹細胞の増殖に起因します。しかし、球は本質的に低くても播種密度35で融合する傾向があるダイナミックな構造です。細胞をプレーティングすることは、プロトコルにおける重要なステップであり、1つの細胞/ウェルの密度は確かに集約問題を回避することができます。しかし、たとえ前向きソート前駆細胞のために、これは定期的に低い固有の球形成活性に非常に低い球の形成をもたらし、またによる希釈効果に限定されるもので自己分泌刺激に起因します。我々の経験では、播種した細胞の30%のみが球体を形成することができることを観察しました。我々は一貫して再現性のある結果を得るために/よく、少なくとも100個の細胞を使用することをお勧めします。
成長CSCに対する他の培養方法は、Mに基づいて、固体または半固体の3D培養( 例えば、に基づいていますatrigel、コラーゲンまたはメチルセルロース)。これらの方法は、細胞の移動およびその後の細胞の集合36を制限するために使用されてきました。しかし、これらの行列の各々は、独自の制限を有します。例えば、マトリゲルは、エンゲル·ホルム·スワン(EHS)腫瘍から単離された可溶性基底膜であり、抽出物は、多くの組織に見られる複雑な細胞外腫瘍環境に似ているが、それは多くの場合、機械的なレンダリング複数多かれ少なかれ定義された成長因子を含んでいます非常に困難な特定の調節エレメントのための研究。対価のもう一つのポイントは、球形成能力をし、幹細胞の機能が交換可能な用語34ではないということです。特定の幹細胞および前駆細胞は、in vivoでの幹/前駆機能を除外するものではないin vitroでの球を生成するための球形成能37、故障を示すことが示されているが。例えば、静止状態の幹細胞は、単にによって提供外の合図に応答しないことがあります体外培養条件で選択。したがって、 インビトロおよび精製された細胞集団のインビボでの自己再生能力の長期的には、優先的に連続継代中に、幹細胞の機能を証明または反証するために評価されるべきです。この文脈では、前向きと同時に幹細胞および前駆細胞の多様な集団を増殖させる能力は、球体形成アッセイの重要な側面であり、CSCのフィールドのために非常に価値のあるこのアッセイを描画します。限りその限界が得られたデータの解釈の際に留意されます。
球形成アッセイは広く遡及インビトロで単一細胞レベルでの自己再生および分化の能力に基づいて幹細胞を同定するために使用されています。それらのインビボニッチからの幹細胞およびそれらの子孫の将来の分離を可能にするマーカーの発見は精製集団の機能的特性を定義することができます。 C言語球形成アッセイおよびFACSのombinationは、固形組織から細胞を単離または培養中のPDACの特定の亜集団を豊かにするための成功戦略です。元の腫瘍の不均一性を反映し、自己再生、分化し、腫瘍を開始:例えば、EpCAMを、CD24およびCD44の同時発現は、することができるのCSCの亜集団を定義します。ヘルマンら 。 CD133 +細胞は増強増殖能力を保有し、CSCが15を備えていることを示しました。他のマーカーはまた、CSCをの特徴付けのために使用されている:ALDH- 1(アルデヒドデヒドロゲナーゼ-1)の発現が膵臓癌38において非常に腫瘍形成性細胞と関連しています。 DNA色素ヘキスト33342を排除することができる細胞は、名前のサイドポピュレーション(SP)細胞は、腫瘍39を開始することが証明能力を有します。最近、我々は、細胞内の自家蛍光の区画が異なる腫瘍タイプにわたって排他CSC形質を持つヒト細胞の別個の集団を特徴づけることが示されました40。これらのマーカーのいずれも選択のCSCの純粋な集団を特徴づけるために表示されませんが、マーカーのより多くの複雑な組み合わせは、細胞のより洗練された集団を精製し、FACSに使用する必要があります。
多くの質問はまだ正確な起源のCSCの役割、進行、および腫瘍の薬剤耐性について残ります。例えば、単一のCSCは、腫瘍を開始する場合、どのように定義するためにクローン進化の問題に対処するための一つの方法は、疾患の異なる段階で患者の試料を分析し、具体的には、治療中および治療後のCSCを数に従うことである可能性があります。これらの質問に答えることによって、我々は、固形腫瘍内のCSCの我々の知識の意味のある進展を行い、最終的には腫瘍の進行や再発を防止するための薬物療法を開発することができます。
The authors have nothing to disclose.
本研究はでサポートされていたERC高度な研究者グラント(PA-CSC 233460)、グラント契約なし256974(EPC-TM-NET)となし602783(CAM-PACの下に欧州共同体のセブンス枠組み計画(FP7 / 2007から2013) )、Subdirección一般デEvaluaciónY Fomento·デ·ラ·Investigación、フォンド·デ·InvestigaciónSANITARIA(PS09 / 02129&PI12 / 02643)、およびPROGRAMAナシオナルデInternacionalización·デ·ラ·I + D、Subprogramma:FCCI 2009(PLE2009-0105; MINISTERIOデEconomíaY Competitividad、スペイン)。 E. Lonardoはロシュフェローシップによってサポートされていました。 M. Cioffiは、ラ·カイシャ博士号を取得する前のフェローシップ·プログラムによってサポートされていました。
Counting Chamber/Hemocytometer | Hausser Scientific Co | 3200 | |
CASY Cell Counter and Analyzer for proliferation and viability measurement | Roche Innovatis | AG CASY Model TTC 45,60,150 μm | |
GentleMACS Dissociator | Miltenyi Co | 130-093-235 | |
GentleMACS C Tubes | Miltenyi Co | 130-093-237 | |
24-well Ultra-low Attachment Plates | Corning | 3474 | |
100-mm tissue culture dishes | BD Falcon | 353803 | |
Cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
15-mL polypropylene conical tube | BD Falcon | 352097 | |
50-mL polypropylene conical tube | BD Falcon | 352070 | |
1.5 ml sterile tubes | Eppendorf | 0030 120.086 | |
50 ml centrifuge tubes | Corning | 430828 | |
Sterile petri dishes, 10 cm dishes | Corning | 353003 | |
26G needles | BD Falcon | 300600 | |
100 ul Hamilton Syringe | Hamilton Syringe Co | 81075 | |
Collagenase type IV | Stem Cell Technologies | 7909 | |
RPMI Medium 1640 | Life technologies | 11875-085 | |
Penicillin/Streptomycin solution, 100X | Life technologies | SV30010 | |
Metformin | Sigma | D150959-5G | |
L-glutamine, 200 mM, 100X | Life technologies | 25030-081 | |
D-Glucose | Sigma | G8270 | |
100mM Sodium Pyruvate solution | Life technologies | 11360-070 | |
Seahorse Assay medium | Seahorse Bioscience | 100965-000 | |
BD Cell-TAK Cell and Tissue adhesive | BD Biosciences | 354240 | |
Trypsin solution, 0.05% | Life technologies | 25300054 | |
B27 Supplement 50x | Life technologies | 17504-044 | |
Basic Fibroblast Growth Factor | Sigma | F0291 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma | A9576 | |
Dulbecco’s Modified Eagle Medium/F12 | Sigma | D8437 | |
Sterile 1x Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma | D8537 | |
Trypan Blue | Life technologies | 15250-061 | |
Carboxy-DCFDA(5-(and-6)-Carboxy-2',7'-DichlorofluoresceinDiacetate) | Life technologies | C-369 | |
Rotenone | Sigma | R8875 | |
Ethanol 70% (vol/vol) | Sigma | 459844 | |
Isofluorane | IsoVet, Braun | 571105.8 | |
Matrigel | BD Biosciences | 35620 | |
Sterile Cotton tipped applicator | Puritan medical | ||
XF96e FluxPak with cell plates, calibrant and cartridges | Seahorse Bioscience | 102416-100 | |
XF96e Extracellular Flux analyzer | Seahorse Bioscience | ||
Incubator with CO2 input | |||
Micro scissors | |||
Curved forceps | |||
Splinter forceps | |||
Caliper |