Summary

تقنية التخصيب الأمثل للعزل<em> الفصلاء</em> أنواع الجراثيم من عزلات عينة التربة

Published: April 09, 2015
doi:

Summary

We present an enrichment protocol for the isolation of bacteriophages infecting bacteria in the Arthrobacter genus. This enrichment protocol produces fast and reproducible results for the isolation and amplification of Arthrobacter phages from soil isolates.

Abstract

Bacteriophage isolation from environmental samples has been performed for decades using principles set forth by pioneers in microbiology. The isolation of phages infecting Arthrobacter hosts has been limited, perhaps due to the low success rate of many previous isolation techniques, resulting in an underrepresented group of Arthrobacter phages available for study. The enrichment technique described here, unlike many others, uses a filtered extract free of contaminating bacteria as the base for indicator bacteria growth, Arthrobactersp. KY3901, specifically. By first removing soil bacteria the target phages are not hindered by competition with native soil bacteria present in initial soil samples. This enrichment method has resulted in dozens of unique phages from several different soil types and even produced different types of phages from the same enriched soil sample isolate. The use of this procedure can be expanded to most nutrient rich aerobic media for the isolation of phages in a vast diversity of interesting host bacteria.

Introduction

في كل مكان من الأنواع الفصلاء في بيئات التربة يقدم عدد كبير وتنوع فاجات قابلة للعزل من هذه الأنواع من البكتيريا المضيف. أعضاء البكتيري للأسرة Acintobacteriaceae هم أبرز لمسارات تقويضي بهم من تدهور مركبات المتمردة مثل الأترازين ومختلف المبيدات الحشرية ومبيدات الأعشاب الأخرى 1،2،3. على الرغم وقد تم ذلك معظم الأبحاث باستخدام سلالات البيئية للالفصلاء، العزلات السريرية لهذا جنس وجدت في الدم والبول، والعيون، والعديد من المصادر البشرية الأخرى عن عرض التجانس النشوء والتطور 4.

في حين أن هناك مجموعة واسعة بدلا من البحث عن البكتيريا الفصلاء، فقط تقرير عدد قليل من الدراسات على فاجات القادرة على إصابة أفراد هذا الجنس المتنوع. على الرغم من المثير للاهتمام، العمل المنجز سابقا على الفصلاء فاجات اللمسات على عدة مواضيع رئيسية متميزة مثل الكتابة التربة <م> الأنواع الفصلاء والاستخدامات الصناعية بهدف الحد من رغوة الضارة في محطات معالجة الحمأة المنشطة والعمل تسليط الضوء على إعادة التركيب محدد الموقع والجينات إنزيم مدمج 7.

وقد استخدمت مختلف البروتوكولات تقنية تخصيب اليورانيوم لتوليد نقية فج يعزل في الأنواع الفصلاء. وتشمل الإجراءات المبكرة حضانات من التربة مع المواد السامة المضافة مثل الأملاح النيكوتين لفترات تزيد على سنة واحدة 8 مما أدى إلى فاجات القادرة على إصابة فقط A. globiformis. يسيل دراسات أجريت باستخدام التربة مع ظهرت العضوية عطوب لإنتاج فاجات اكتشافها عن طريق تقنيات فحص اللوحة، وحذف فترات حضانة طويلة 8. على الرغم من المثير للاهتمام، تم استخدام تقنية تشبه الطلاء المباشر في الماضي مما أدى إلى عدة فاجات في حين لا تزال تواجه نسبة نجاح منخفضة وخاصة من قبل المحققين نقلا عن الدراسات السابقة مع معدلات النجاح منخفضة <sتصل> 8.

وعموما، كانت تقنيات عزل استخدمت في الماضي بارزة لديها فعالية كبيرة في الممارسة على الرغم من جنس الفصلاء تمثل التربة الهوائية الأكثر شيوعا عزل في الطبيعة 4،9،، فان Twest وKropinski 10 طرق لتخصيب الحالية لعزل فاجات من المياه والتربة مقتبس من التقنيات السابقة المستخدمة في تخصيب العزلات البكتيرية البيئية ولكن تقنيات تخصيب هذه أثبتت عدم كفاءة في عزل فاجات الفصلاء. والغرض من هذا الأسلوب هو موضح هنا هو إظهار "دليل على مفهوم" أن أساليب التخصيب في وقت مبكر يمكن تكييفها لباستمرار وبشكل فعال عزل فاجات الفصلاء، والتغلب على التحديات التقنية السابقة المرتبطة عزل فاجات من هذا جنس البكتيريا.

Protocol

1. إعداد الخلايا Arthobacter لفج عزل ثقافة الفصلاء س. يشوبه KY3901 المستعمرات على لوريا Bertaini (LB) لوحة أجار المحتضنة في 30 درجة مئوية لمدة 2-3 أيام. اختيار مستعمرة واستخدام حلقة عقيمة لإضافته إلى 250 مل من مرق LB في قارورة ال?…

Representative Results

لإثبات استنساخ لتحسين تقنية تخصيب للفاجات الفصلاء، استخدمت 30 عينات من التربة مختلفة في أوقات مختلفة وأماكن خلال فصلي الربيع والصيف من عام 2014. ومن بين هذه العينات 30 التربة تم الحصول فاجات الفصلاء فريدة من 22 من عينات التربة التي تم جمعها باستخدام هذا التخصيب …

Discussion

وعلى الرغم من العديد من المحاولات السابقة لعزل فاجات القادرة على إصابة المضيفين الفصلاء، كان لدينا نجاح يذكر باستخدام إجراءات تخصيب القياسية. طريقة المعمم تخصيب البكتيرية المتقدمة وتكييفها من قبل فان Twest وKropinski 10 إلى إثراء فاجات من العينات البيئية يبقى ا?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

تم توفير التمويل لتطوير هذا البروتوكول من قبل اتحاد جنوب شرق ولاية بنسلفانيا للتعليم العالي ووزارة العلوم كابريني كلية. وجاء التمويل ودعم إضافي من جامعة أركاديا وجامعة الطاهرة. نشكر خصوصا الدكتورة كارين Snetselaar في جامعة القديس يوسف لتتكرم أخذ الصور الإلكترون المجهري من فاجات معزولة لدينا. وقدم دعم إضافي من قبل الصيادين معهد هوارد هيوز الطبي التحالف تعليم العلوم فج النهوض علم الجينوم والتطوري العلوم برنامج (SEA-فاجات).

Materials

LB Broth powder Fisher BP9722-2 It's best to order these in bulk.
Granulated Agar Fisher BP1423-2 It's best to order these in bulk.
0.22 um syringe filters Fisher 09-719A
.22 um buchner filters Fisher 430320 More than 50 mL of liquid can be obtained by carefully swapping the receiving tube.
Eppendorf Tubes Fisher 05-408-129
5 mL pipets individual Fisher 13-678-11D
50 mL conical tubes Fisher 76002844
15 mL conical tubes Fisher 76002845
10 mL pipets individual Fisher 13-676-10J
25 mL pipets individual Fisher 13-676-10K
Whatman qualitative filter paper Fisher 1001-824

References

  1. Shapir, N., Mongodin, E. F., Sadowsky, M. J., Daugherty, S. C., Nelson, K. E., Wackett, L. P. Evolution of Catabolic Pathways: Genomic Insights into Microbial s-Triazine Metabolism. J Bacteriol. 189 (3), 674-682 (2007).
  2. Qingyan, L., Ying, L., Xikun, Z., Baoli, C. Isolation and Characterization of Atrazine Degrading Arthrobacter sp. AD26 and Use of this Strain in Bioremediation of Contaminated Soil. J Environ Sci. 20, 1226-1230 (2008).
  3. Wang, J., Zhu, L., Liu, A., Ma, T., Wang, Q., Xie, H., Wang, J., Jiang, T., Zhao, T. Isolation and characterization of an Arthrobacter sp. Strain HB-5 that Transforms Atrazine. Environ Geochem Hlth. 33, 259-266 (2011).
  4. Mages, I. S., Frodl, R., Bernard, K. A., Funke, G. Identities of Arthrobacter spp. And Arthrobacter-Like Bacteria Encountered in Human Clinical Specimens. J Clin Microbiol. 46 (9), 2980-2986 (2008).
  5. Brown, D. R., Holt, J. G., Pattee, P. A. Isolation and Characterization of Arthrobacter Bacteriophages and Their Application to Phage Typing of Soil Arthrobacters. Appl Environ Microbiol. 35 (1), 185-191 (1978).
  6. Petrovski, S., Seviour, R. J., Tillett, D. Prevention of Gordonia and Nocardia Stabilized Foam Formation by Using Bacteriophage GTE7. Appl Environ Microbiol. 77 (21), 7864-7867 (2011).
  7. Le Marrec, C., Moreau, S., Loury, S., Blanco, C., Trautwetter, a. Genetic Characterization of Site-specific Integration Functions of phi AAU2 infecting “Arthrobacter aureus” C70. J Bacteriology. 178 (7), 1996-2004 (1996).
  8. Casida, L. E., Liu, K. C. Arthrobacter globiformis and Its Bacteriophage in Soil. J Appl Microbiol. 28 (6), 951-959 (1974).
  9. Einck, K. H., Pattee, P. A., Holt, J. G., Hagedorn, C., Miller, J. A., Berryhill, D. L. Isolation and Characterization of a Bacteriophage of Arthrobacter globiformis. J Virol. 12 (5), 1031-1033 (1973).
  10. Twest, R., Kropinski, A. M. Bacteriophage Enrichment from Soil and Water. Methods Mol Bio. 501, 15-21 (2009).
  11. Fullner, K. J., Hatfull, G. F. Mycobacteriophage L5 Infection of Mycobacterium bovis BCG: Implications for Phage Genetics in the Slow-growing Mycobacteria. Mol Microbiol. 26 (4), 755-766 (1997).
  12. Robb, S. M., Woods, D. R., Robb, F. T. Phage Growth Characteristics on Stationary Phase Achromobacter cells. J Gen Virol. 41 (2), 265-272 (1978).
  13. Bolger-Munro, M., Cheung, K., Fang, A., Wang, L. T4 Bacteriophage Average Burst Size Varies with Escherichia coli B23 Cell Culture Age. Journal of Experimental Microbiology and Immunology. 17, 115-119 (2013).

Play Video

Cite This Article
Cross, T., Schoff, C., Chudoff, D., Graves, L., Broomell, H., Terry, K., Farina, J., Correa, A., Shade, D., Dunbar, D. An Optimized Enrichment Technique for the Isolation of Arthrobacter Bacteriophage Species from Soil Sample Isolates. J. Vis. Exp. (98), e52781, doi:10.3791/52781 (2015).

View Video