Summary

Anwenden Stereotaktische Injektionstechnik zu genetischen Auswirkungen auf die Tier Behaviors Studie

Published: May 10, 2015
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Summary

Stereotaktische Injektion von Lentiviren ausdrücken cDNAs oder shRNAs die Genexpression in spezifischen Hirnarealen von Mäusen zu modulieren. Hier präsentieren wir ein Protokoll zur stereotaktischen Injektionen mit Verhaltensaufgaben, wie der Open Field Test (OFT) und Forced Swim Test (FST) zu kombinieren.

Abstract

Stereotaktische Injektion ist eine nützliche Technik, um hohe Titer Lentiviren gezielt Gehirnbereiche in Mäusen zu liefern. Lentiviren kann entweder überexprimiert oder Zuschlags Genexpression in einer relativ fokussierten Bereich ohne signifikante Schädigung des Gehirngewebes. Nach der Wiederherstellung kann der eingespritzte Maus auf verschiedene Verhaltens Aufgaben wie die Open Field Test (OFT) und Forced Swim Test (FST) getestet werden. OFT ist entworfen, um die Fortbewegung und die bestrebt Phänotyp bei Mäusen durch Messung der Menge an Zeit, die eine Maus in die Mitte einer neuen offenen Feld ausgibt beurteilen. Ein ängstlicher Maus wird deutlich weniger Zeit in der Mitte des Romans Feld im Vergleich zu Kontrollen zu verbringen. Die FST beurteilt die anti-depressive Phänotyp durch Quantifizieren der Menge an Zeit, die Mäuse verbringen unbeweglich, wenn sie in einen Eimer Wasser gegeben. Eine Maus mit einer antidepressiven Phänotyp signifikant weniger Zeit unbeweglich Vergleich zu Kontrolltieren zu verbringen. Ziel dieses Protokolls ist es, die ster verwendeneotactic Injektion eines Lentivirus in Verbindung mit Verhaltenstests zu beurteilen, wie genetische Faktoren modulieren tierischen Verhaltensweisen.

Introduction

Die Maus wurde vielfach in der Neurobiologie verwendet, weil es leicht ist, genetisch zu manipulieren. Gen-Knockout-Techniken können die Forscher untersuchen, wie die einzelnen genetischen Faktor formt Maus Verhaltensweisen. Darüber hinaus stellt die cre-loxP-System ein wertvolles Werkzeug für die Gewebe- und Zell arttypischer Gen-Knockout-Mäusen, die Forschern die Genfunktion in verschiedenen Geweben zu untersuchen. 1, in der Praxis sind jedoch Expressionsmuster von cre Promo schwer kontrollierbar und bisher viele etablierte cre Treiber nicht regionsspezifische Expression erreicht. 2,3

Alternativ ist die stereotaktische Injektion eine Methode, die spezifischen Regionen des Gehirns von erwachsenen Maus als Ziel hat. Durch Einspritzen von gentechnisch hergestellten Viren, die cDNA oder shRNA kann regionsspezifische Modulation der Genexpression erreicht werden. Obwohl das Gehirn Größe jeder Maus variiert, kann der Ort des spezifischen Hirnregionen mit stereo Koordi bestimmt werdennates gesetzt von Landmarken auf dem Schädel des Maushirn. Die am häufigsten verwendeten Landmarken Bregma, lambda und der interauralen Linie. Mit Hilfe von Koordinaten aus einer Hirnatlas erhalten können 4 die genaue Position jedes Hirnareal durch die von vorne nach hinten (A / P), medial-lateral (M / L) identifiziert werden kann, und dorsal-ventralen (D / V) Achsen aus bregma / interauralen Linie Kreuzung. Typischerweise Viren in die Gehirne von Mäusen injiziert werden, entweder rot oder grün fluoreszierendes Protein (RFP oder GFP) markiert, so dass Injektionen können durch Fluoreszenzmikroskopie bestätigt.

Verhaltens Beurteilungen der Mäuse sind besonders für die Grundlagenforschung von psychiatrischen Störungen nötig. Symptome von psychiatrischen Störungen bei Patienten typischerweise abnorme Verhaltensweisen. Einige dieser Verhaltensweisen des Menschen, sind konserviert und kann direkt imitiert und in der Maus beobachtet werden. Beispielsweise kann Depressionen in der Maus durch Messen behavioral despair modelliert werden. Menschen mit Depressionen often das Gefühl, dass sie nichts tun überhaupt helfen, ein Symptom, das schließlich zum Selbstmord führen können. In Nagetiere, kann dies mit Hilfe der Zwangsschwimmtest (FST), die die Zeitdauer eine Maus schwimmen gegen schwebend in einem Pool von Wasser (als Aufgeben gesehen) misst modelliert werden. Dieses Paradigma wird durch die Rettung des Phänotyps mit Antidepressiva validiert. 7,8,9 Mäuse, die Antidepressiva erhalten haben erheblich weniger Zeit unbeweglich im Vergleich zu unbehandelten Kontrollen zu verbringen. Eine andere Verhaltenstest, der Open Field Test (OFT) wurde entwickelt, um die Fortbewegung in den Mäusen zu bewerten, und zusätzlich kann der ängstliche Phänotyp in Mäusen zu analysieren. 5,6 Dieser Test beruht auf der Prämisse, dass Mäuse fühlen sich sicherer, wenn sie in der Nähe sind an der Wand in einer neuen offenen Feld. Wildtyp-Mäusen werden schließlich entdecken Sie die neue Umgebung, wie sie neugierige Tiere sind. Jedoch weniger Zeit in der Mitte des Feldes zeigt Angst in der Maus, die Maus nicht in der Lage, um die Initia überwindenl Angst auf eine neue Umgebung gebracht. Die Angst der Maus, wie durch die Menge an Zeit in der Mitte ein offenes Feld verbracht quantifizieren kann, um klinische Angst bei Menschen, die in vielen psychiatrischen Störungen vorhanden ist, verglichen werden.

Die Kombination von stereo Injektionen Verhaltensparadigmen ist eine neuartige Weise, um die Expression eines bestimmten Gens gezielt Gehirnbereich zu ändern. Die Wirkung von modulierten Genexpression Auslösern kann dann bestimmt werden. Im Gegensatz zur Gesamthirn Knockout ist dieses Verfahren besonders nützlich, da sie Ziele nur bestimmte Hirnareale. Darüber hinaus werden der stereotaktischen Injektionen typischerweise im erwachsenen Wildtyp-Maus durchgeführt wird, also die endogene Genexpression gesamten Entwicklungsstufen beibehalten. Diese Methode wird die Wirkung verwechseln zu vermeiden, wenn das Gen für das Überleben während der embryonalen und postnatalen Entwicklungsphase erforderlich. Eine wichtige Einschränkung ist, dass die Versuchsmäuse gehen müssen through eine invasive Chirurgie, in der die Schädel von Mäusen geöffnet werden. Darüber hinaus wird der Grad der Genmodulation durch den Titer und die Effizienz des Virus bestimmt. Das Virus muss in die richtige Region mit stereotaktischen Koordinaten, die spezielle Instrumente erfordert injiziert werden. Überprüfung der korrekten Injektionsstelle kann nur post mortem durchgeführt werden.

Dieses Verfahren wurde früher verwendet, um die Beteiligung eines spezifischen Gens in verschiedenen neurologischen Krankheiten zu prüfen. Zum Beispiel virale vermittelte gerichtete RNAi TH-Gen (die Dopamin synthetisieren können) in die Substantia nigra compacta eingespritzt wird, und den Bewegungsverhaltensanalyse wurde durchgeführt. 10 einer anderen Studie wurden stereotaktische Injektion eines Lentivirus silencing DISC1 Maus Verhalten in Bezug zu beurteilen um Schizophrenie. Knockdown von DISC1 führte zu einer erhöhten Fortbewegung in Reaktion auf die Neuheit (Parallelen positive Symptome der Schizophrenie) und größer Unbeweglichkeit in derFST. 11 In ähnlicher Weise eine weitere Studie ergab, dass 5-HT 1B Expression zu erhöhten Explorationsverhalten im OFT, konsistent mit einem Anti-Angst-Phänotyp mit dieser Methode. 12 Stereotaktische Injektionen können cre Virus zu liefern, um die Rekombination in cre-loxP-Mäusen zu induzieren . Diese Methode wurde verwendet, um die Y2-Rezeptor in die Amygdala und der Bettkern der Stria terminalis selektiv zu löschen. Auf Verhaltensanalyse wurden diese Mäuse mit einem anti-depressive Phänotyp, wenn das Gen in der zentralen Amygdala gelöscht gefunden, aber keine Phänotyp, wenn das Gen in die basolaterale Amygdala oder Bett Kern der Stria terminalis gelöscht. 13. Somit ist diese Technik bietet ein einzigartiges Werkzeug, um die genetischen Auswirkungen auf die Tierverhalten zu studieren.

Protocol

HINWEIS: Alle Protokolle mit Tieren wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien der Tierpflege der Pennsylvania State University folgte, IACUC # 44057 1. Lentivirus Produktion HINWEIS: Der Tag vor der Transfektion sollten LentiX-293-Zellen bei 80% Konfluenz sein. Spülen Zellen mit DMEM kurz vor der Transfektion und Inkubation in 10 ml DMEM / 10% FBS mit Penicillin (100 IU / ml) und Streptomycin (100 ug / ml) für 5 min bei RT. Verdünnte …

Representative Results

Genaue stereotaktische Injektion stützt sich stark auf die Einstellung der richtigen Koordinaten. Die Spitze der Nadel verwendet, um das Virus zu injizieren sollte direkt an der Kreuzung der Bregma und der interauralen Linie (Abbildung 1) eingestellt werden. Es ist hilfreich, ein Stereomikroskop verwenden, um festzustellen, ob die Nadel richtig sitzt. Beim Blick durch das Mikroskop, sollte die Nadel positioniert werden, dass, wenn das Virus injiziert wurden, wäre es direkt an der Kreuzung der Br…

Discussion

Erfolgreiche stereotaktische Injektionen verlassen sich auf drei Faktoren ab: Halten Sie die Maus lebendig, Einstellung der korrekten Nullpunkt für Koordinaten (Spitze der Nadel an der Kreuzung der Bregma und der interauralen Linie) und die Einstellung der richtigen Tiefe auf den Nullpunkt (Spitze der Nadel leicht berührt die Außenseite des Hirngewebe). Die Lebensfähigkeit der Mäuse ist wichtig. Chirurgie Überleben kann, indem sichergestellt wird, dass die Maus richtig betäubt und erhält eine angemessene analget…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work is supported in part by American Heart Association Scientist Development Grant and NARSAD Young Investigator Award to Yingwei Mao.

Materials

Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
Stereotactic Apparatus item 51725 Stoelting co. 51725
Quintessential stereotaxic pump  Stoelting co. 53311
Injection Styringe, 65 RN Hamilton 7633-01
DMEM Sigma-Aldrich D5796
PEI  Polysciences Inc. 23966
Scissors Fine Surgical Tools 14084-08
Blunt end forceps Fine Surgical Tools 11002-12
Needle holder  Fine Surgical Tools 12001-13
Drill Ram Products Inc Microtorque control box, Tech2000 handpiece with pedal
Glass bead sterilizer Inotech  IS-400
Absorbable sutures  Unify M-K518r19 Absorbable, reverse cutting
Cotton swabs VWR 89031-270
Heating pad Gaymar T-pump TP-500 PN11184-000
Artificial tears Rugby NDC 0536-6550-91
Disposable syringe BD Syringe 309623
Cloth
Gloves  Ansell Senseitouch #7823
Avertin or other anesthetic see recipe citation
Ketoprofen or other analgesic see veternarian 
Tracking software Noldus Ethovision XT
Tracking Camera Noldus Media Recorder

References

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Cite This Article
McSweeney, C., Mao, Y. Applying Stereotactic Injection Technique to Study Genetic Effects on Animal Behaviors. J. Vis. Exp. (99), e52653, doi:10.3791/52653 (2015).

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