Lepr<sup> Db</sup> Modèle de souris de diabète de type 2: pancréatique isolement des îlots et des cellules vivantes 2-Photon Imaging d'îlots intacts
Summary
We present here a protocol for the isolation of islets from the mouse model of type 2 diabetes, Leprdb and details of a live-cell assay for measurement of insulin secretion from intact islets that utilizes 2 photon microscopy.
Abstract
Le diabète de type 2 est une maladie chronique qui touche 382 millions de personnes en 2013, et devrait atteindre 592 millions d'ici 2035 1. Au cours des deux dernières décennies, le rôle de la dysfonction des cellules bêta dans le diabète de type 2 a été clairement établi 2. progrès de la recherche a nécessité des procédés pour l'isolement des îlots pancréatiques. Le protocole de l'isolement des îlots présenté ici part de nombreuses étapes communes avec des protocoles d'autres groupes, avec quelques modifications pour améliorer le rendement et la qualité des îlots isolés à la fois du type sauvage et db Lepr diabétique de souris (db / db). Un des cellules vivantes Procédé d'imagerie à 2 photons est ensuite présenté qui peut être utilisée pour étudier le contrôle de la sécrétion d'insuline des îlots à l'intérieur.
Introduction
Le rôle d'un dysfonctionnement des cellules bêta dans la maladie a été largement reconnu 3,4. Des lignées cellulaires telles que la MIN6 et INS-1 sont des outils utiles pour comprendre la biologie de comportement des cellules bêta. Toutefois, le contrôle physiologique de la sécrétion d'insuline a lieu dans les îlots de Langerhans. Ces îlots contiennent des milliers de cellules bêta serrées, ainsi que les vaisseaux sanguins et d'autres types de cellules endocrines. Cet environnement au sein de l'îlot influe sur la sécrétion d'insuline et est susceptible d'être important dans le diabète. Par conséquent, pour comprendre le contrôle physiologique de la sécrétion d'insuline, et la physiopathologie de la maladie, il est essentiel d'étudier îlots intacts.
isolement des îlots
Îlots humains vivants et, en particulier, des îlots humains provenant de patients atteints de diabète de type 2 sont difficiles à obtenir. En outre, des îlots humains ont des possibilités limitées pour la manipulation moléculaire expérimentale. Les chercheurs ont donc utilisé estpermet à partir d'animaux et des modèles animaux de diabète de type 2. Un tel modèle de la maladie est la souris db / db. Ceci est une mutation spontanée que les modèles diabète de type 2 avec une progression de phénotype qui se rapproche étroitement de la maladie humaine 5,6. Le protocole présenté ici pour isolement des îlots de souris db / db diabétiques comporte de nombreuses étapes en commun avec d'autres groupes avec quelques améliorations pour un meilleur rendement, la purification et le renforcement de la survie de l'îlot.
2 imagerie photonique
Le dosage des cellules vivantes 2 photons décrit ici permet aux chercheurs de quantifier le nombre et évaluer les caractéristiques des granulés contenant de l'insuline à partir de cellules simples de 7 et diabétique de type sauvage îlots 8,9.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le facteur le plus critique dans l'isolement d'îlots est la perfusion initiale du pancréas; un sous perfusion du pancréas résultats avec un rendement d'îlots considérablement plus faible. D'autres facteurs affectent également la qualité de l'isolation tel que le temps de digestion et le niveau d'agitation qui peut compenser en partie au niveau de la perfusion. Par exemple, un pancréas perfusés pleinement devra être incubées à 37 ° C pendant ~ 18 min 30 sec tout en agitant doucement,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by an Australian Research Council Grant DP110100642 (to PT) and National Health and Medical Research Council Grants APP1002520 and APP1059426 (to PT and HYG).
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Liberase TL 5mg | Roche | -5401020001 | |
| Collagenase type IV-1g | Gibco-Life Technologies | 17104-019 | |
| Histopaque 1077 500ml | Sigma Aldrich | 10771 | |
| RPMI 1640 Medium (10X) 1L | Sigma Aldrich | R1383 | to prepare isolation media |
| RPMI 1640 (1X) 500ml | Gibco-Life Technologies | 21870-076 | to prepare cultured media |
| Penicillin-Streptomycin 100ml | Gibco-Life Technologies | 15140-122 | to prepare cultured media |
| Fetal bovine serum 500ml | Gibco-Life Technologies | 10099-141 | to prepare cultured media |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Gibco-Life Technologies | 11966-025 | to dilute the liberase |
| Metamorph program | Molecular Devices, USA | to analyze the 2-photon images |
References
- Guariguata, L., et al. Global estimates of diabetes prevalence for 2013 and projections for 2035. Diabetes Research and Clinical Practice. 103, 137-149 (2014).
- Ashcroft, F. M., Rorsman, P. Diabetes mellitus and the beta cell: The last ten years. Cell. 148, 1160-1171 (2012).
- Weir, G. C., Bonner-Weir, S. Five stages of evolving beta-cell dysfunction during progression to diabetes. Diabetes. 53, S16-S21 (2004).
- Kjorholt, C., Akerfeldt, M. C., Biden, T. J., Laybutt, D. R. Chronic hyperglycemia, independent of plasma lipid levels, is sufficient for the loss of beta-cell differentiation and secretory function in the db/db mouse model of diabetes. Diabetes. 54, 2755-2763 (2005).
- Wang, Y. W., et al. Spontaneous type 2 diabetic rodent models. Journal of Diabetes Research. , (2013).
- Hummel, K. P., Dickie, M. M., Coleman, D. L. Diabetes a new mutation in mouse. Science. 153, 1127-1128 (1966).
- Do, O. H., Low, J. T., Gaisano, H. Y., Thorn, P. The secretory deficit in islets from db/db mice is mainly due to a loss of responding beta cells. Diabetologia. 57, 1400-1409 (2014).
- Low, J. T., et al. Glucose principally regulates insulin secretion in mouse islets by controlling the numbers of granule fusion events per cell. Diabetologia. 56, 2629-2637 (2013).
- Takahashi, N., Kishimoto, T., Nemoto, T., Kadowaki, T., Kasai, H. Fusion pore dynamics and insulin granule exocytosis in the pancreatic islet. Science. 297, 1349-1352 (2002).
- Low, J. T., et al. Insulin secretion from beta cells in intact mouse islets is targeted towards the vasculature. Diabetologia. 57, 1655-1663 (2014).
- Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes. Biomedical Engineering Online. 2, 13 (2003).
