Drosophila melanogaster is an outstanding model organism for studying innate immune systems and the physiological consequences of infection and disease. This protocol describes how to deliver robust and quantitatively repeatable bacterial infections to D. melanogaster, and how to subsequently measure infection severity and quantify the host immune response.
Meyve Drosophila melanogaster bağışıklık savunma fonksiyonu ve evrim eğitimi için önde gelen model organizmaların biridir sinek. Doğuştan gelen bağışıklık birçok yönleri böcekler ve memeliler arasında muhafaza edilir ve Drosophila kolayca genetik ve deneysel manipüle edilebilir, çünkü onlar bağışıklık sistemi fonksiyonunu ve hastalığın fizyolojik sonuçlarını incelemek için güçlüdür. Burada gösterilen prosedür epitel engelleri ve savunma daha pasif formları atlayarak ve sistemik enfeksiyon odağı sağlayan doğrudan vücut boşluğuna bakterilerin getirilmesi ile sineklerin enfeksiyon izin verir. Prosedür ana ölüm sistemik patojen yükü ve konakçı bağışıklık sisteminin indüksiyonunun derecesinin ölçülmesi oranları için kuralları içerir. Bu enfeksiyon prosedürü, ucuz, sağlam ve kantitatif tekrarlanabilir ve fonksiyonel genetik, evrimsel yaşam öyküsü ve fizyoloji çalışmalarında kullanılabilir.
Meyve sineği Drosophila Melanogaster'in, deneysel manipülasyon için son derece müsait olan ve geniş geliştirdi geniş bir bilim camiası tarafından desteklenmektedir fonksiyonu ve bağışıklık savunma. Drosophila evrimini ucuz ve arka kolay çalışmak için önde gelen model organizmaların biridir araştırma araçları dizisi. Doğuştan gelen bağışıklık birçok yönü Toll benzeri reseptörler ve NF-kB transkripsiyon faktörleri ailesinin, JAK / STAT sinyalleme ve JNK yolunun yanıtları neden olduğu sinyal iletimi dahil olmak üzere, böcekler ve memeliler arasında muhafaza edilir. 1,2, bu genler ve yolların olabilir işlevi D. sorgulanabilir melanogaster mutasyonlar kullanarak veya RNAi o artış veya azalış yolu faaliyetlerini hakemin 3 -. Ayrıca 6, Drosophila evrim yaşam öyküsü teorisi bağlamında da dahil olmak üzere, enfeksiyon ve hastalığın fizyolojik sonuçlarını incelemek için kullanılabilir 7..– 9 Bütün bu çalışmalar, güvenilir tanımlanan tedavi koşullarında deneysel sinekler bulaştırmak için becerisine bağlıdır. Burada açıklanan prosedür Drosophila melanogaster sağlam ve tekrarlanabilir bakteriyel enfeksiyonların teslim ve daha sonra enfeksiyon şiddetini ölçmek ve konak immün yanıtı ölçülmesi için bir metodolojik çerçeve sunmaktadır.
Drosophila doğal ve deneysel olarak, bakteri, mantar, virüs, nematod ve parazitoidi eşekarısı de dahil olmak üzere parazit ve patojenler, geniş bir yelpazede enfekte edilebilir. Geçerli protokol sistemik bakteriyel enfeksiyon sunmaya odaklanmıştır. Birçok farklı bakteri sinekler bulaştırmak için kullanılabilir ve deneycinin tercihi soruluyor kesin bilimsel sorulara dayalı olmalıdır. Örneğin, insan klinik izolatlar bu bakteriyel hastalık oluşturma mekanizmalarının 10 incelemek üzere kullanılabilir, veya ekolojik ilgili izolatları preferre olabilirEvrimsel çalışmanın d. 11 Bazı bakteriler D. yetkili patojenlerdir melanogaster, enfeksiyon üzerine çoğalan ve ev sahibi hastalık veya ölüme neden olur. Diğer bakteriler etkili bir konak bağışıklık sistemi tarafından yönetilen ve birkaç gün içinde temizlenir. Bu gösteri, Providencia rettgeri ana mortaliteye yol açarlar ve kalan ana devam etmektedir. Escherichia coli konakçı bağışıklık sistemi tarafından temizlenir olmayan bir patojen olarak kullanılacak bir proliferatif patojen olarak kullanılacaktır.
Enfeksiyon doğrudan sineğin vücut boşluğuna bakterilerin girişi ile kurulacaktır. Bu yaklaşım ne olursa olsun bulaşma doğal mod sistemik enfeksiyon soruşturma izin epitel engelleri ve koruyucu davranışları atlar. Deneysel olarak, sistemik enfeksiyon oluşturulması için iki temel yöntemden yararlanılmaktadır. İlk olarak, bir nanoinjector ve çekilmiş cam kılcal iğneleri bir tam sayısını enjekte etmek için kullanılırsinek içine bakteriler. Bu yöntem, enfeksiyon doz geniş bir dinamik aralık sağlayan ve kantitatif son derece tekrarlanabilir olma avantajları vardır. İkinci yaklaşım, bir septik Pinpirick enfeksiyonu sunmaktır. Bu yaklaşım, hızlı olmak ve hiçbir özel ekipman gerektiren avantajları vardır. Enfeksiyonlar kurulmuş sonra, sistemik patojen yükü, ev sahibi mortalite ve uyarılabilir bağışıklık sistemi aktivitesini ölçmek mümkün olur. Tabii ki, daha fazla fenotip herhangi bir sayıda makul enfekte D'de ölçülebilir enfeksiyon sonrası verimi 12, öğrenme yeteneği 13, metabolik durumu 14 veya hayal edilebilir neredeyse başka bir özellik de dahil olmak üzere melanogaster.
Burada açıklanan prosedür Drosophila melanogaster titiz ve kaliteli enfeksiyonu verir. resimli örnekler öncelikle Providencia rettgeri ve E ile enfeksiyon üzerinde duruldu E. coli, ancak protokol adapte edilebilir ve ana yetiştirme ve bakım koşulları aralığında, çeşitli bakterilerle enfeksiyon uygulanabilir.
optimal deney yaklaşımının detayları enfeksiyonu için kullanılan bakteri, ev sahibi genotip, ve genel olarak deneysel koşullara bağlı olacaktır. Kuvvetle yeni deney koşulları daha iddialı projeler başlatmadan önce pilot uygulaması tavsiye edilir. İyi bir başlangıç noktası, bir 100-kat aralığında üç enfeksiyon dozlarda test etmektir. Sinek başına 100 bakteri hücreleri – Son derece öldürücü patojenler genellikle en iyi 10 mertebesinde, çok düşük bulaşıcı dozlarda tanıtıldı. Daha ılımlı patojenler fl başına yaklaşık 1000 bakteri yüksek dozlarda enjekte edilebiliry ve olmayan patojenler sinek başına 10,000 bakteri gibi yüksek dozlarda enjekte edilebilir. Bu uzunlamasına zaman serisi üzerinde patojen yükü, ev sahibi mortalite ve bağışıklık sistemi aktivitesini takip ederek yeni enfeksiyonların kinetik tanımlamak için genellikle öğreticidir. Patojen yükü ve bir ev sahibi gen ifadesinin ölçümü tahrip edici deneyler olduğundan, ölçülecek her bir zaman noktası için, deneyin başlangıcında ayrı sinekler enfekte gereklidir.
Iğne veya microcapillary tabanlı enjeksiyon kullanmaya karar verirken, bu avantajları ve sınırlamaları her yaklaşımın var dikkat etmek önemlidir. Kılcal püskürtme hem de sınırlı bir turgor basıncını arttırır ve bunların tuzları ya da süspanse edilmiş veya taşıyıcı madde içinde çözülmüş olan diğer molekülleri sunar sinek içine bir sıvı hacmi getirmektedir. Kılcal enjeksiyonu da gerekli ekipmanların bir enjeksiyon tesisi veya satın alma erişim gerektirir. Septik iğne hiçbir özel ekipman ve tanıtır gerektirirönemsiz sinek içine medya ve tipik sinek çok sayıda bulaştırdıkları daha verimlidir. Ancak, iğne enfeksiyonlar kılcal enjeksiyonu ile elde edilebilir enfeksiyon dozu üzerinde hassas kontrol izin vermez. Mevcut protokol mekanik enjeksiyon hacmi düzenleyen bir enjeksiyon cihazının üzerinde duruldu, ancak basınçlı hava ayrık bakliyat dayalı enjeksiyon sistemleri de vardır. 20,21 Bunlar genellikle cihaz burada özellikli daha pahalı ve her hava darbesinin kalibrasyon gerektiren sırayla iğne tutarlı enjeksiyon hacimleri sağlamak.
Sinekler vahşi bakteri sistemik enfekte nasıl önemli bir tartışma ama çok az veri bulunmaktadır. Bazı araştırmacılar, Drosophila patojenik bakterileri sindirdiğimizde Doğal enfeksiyon çoğunluğu meydana gelen ve bakteriler, daha sonra, sistemik enfeksiyona neden gut kaçış mümkün olduğunu varsaymak. Bununla birlikte, fe ait vardırBilinen w bakteriler D. gut geçmeye muktedir melanogaster ve bu yeteneği var o sinekler 22,23 son derece ölümcül olan. Alternatif bir teori başarısız avlanma girişimleri veya ektoparazitik akarları saldırısından kaçış yoluyla cuticular yaralanmaları sürdürmek düzenli uçar olmasıdır. Bu hipotez, vahşi D. sık koleksiyon tarafından desteklenmektedir iyileşmiş yaralar (yayınlanmamış gözlemler) göstergesidir melanizm noktalar taşıyan melanogaster. Akarlar Drosophila 24 bakteriyel enfeksiyonları iletmek gösterilmiştir ve akarları bıraktığı yaralar ikincil bal arılarının 25 bakteriler tarafından enfekte olabilir. Bununla birlikte, D. tahrik akarlara ya da başka fırsatçı enfeksiyon doğada frekansı manikür ihlalleri ile melanogaster bilinmemektedir. Burada açıklanan protokol doğrudan herhangi bir epitel engelleri ya da davranışsal immu atlar nicel enjeksiyon yoluyla hemolimf içine bakterilerin girişini izin verirdilmekte. D. patojenik bakterilerin beslenmesi için yöntemler melanogaster Vodovar ve ark., 22 ve nehme ve ark., 23 tarif edilmiştir.
Birçok Entomopatojenik bakteri araştırmacı rahatça onlarla çalışmak için izin, az veya hiç insan sağlığı risk oluşturmaktadır. Ayrıca, çok az bakteri deneysel müdahalesi olmadan temas Drosophila bulaştırmak kapasitesine, böylece kirlenmiş yüzeyler aracılığıyla bir laboratuvar ile bakteriyel enfeksiyon "salgın" yayılma riskini ya da genel olarak çok düşüktür sinekler kaçtı. Bununla birlikte, yeterli muhafaza önlemler kaçmasını enfekte sinekler önlemek için ve herhangi bir sinekler kaçan recapturing için olduğundan emin olmak için tavsiye edilir. Laboratuvar kullanılan patojenlerin bununla orantılı bir biyolojik güvenlik seviyesinde donanımlı olmalıdır ve mikrobiyoloji standart en iyi uygulamaların istihdam edilmelidir.
Deneysel infectiBurada tarif edilen yöntem ile ilgili herhangi bir keyfi bakterinin bir dozu ile Drosophila melanogaster enfeksiyonları sağlar. Enfeksiyon bir kez kurulduktan sonra, bu bakteriyel proliferasyonu veya açıklık kinetiklerini ölçmek için ana ölüm izlemek için ve konakçı bağışıklık sisteminin indüksiyonunun tahlil edilmesi basittir. Enfekte sineklerin kolayca şekil ya da enfeksiyonu ile şekillendirilecek fizyolojik fonksiyon testleri de dahil olmak üzere diğer fenotipik tahlillerine tâbi tutulabilir. anlatılan prosedürler, ucuzdur nispeten az özel ekipman gerektirir ve kolayca araştırma ve eğitim laboratuarları bir genişliği boyunca çeşitli projelerde kullanılmak üzere onları mükellef hale öğrenilir.
The authors have nothing to disclose.
We would like to thank the entire Lazzaro lab, and especially Susan Rottschaefer, for their help in both reviewing and testing these protocols. This is a product of their cumulative expertise. Work in the Lazzaro lab is supported by grants R01 AI083932 and R01 AI064950 from the US National Institutes of Health.
Reagent | Company | Part Number |
Incubator | Powers Scientific, Inc | DROS52SD |
Paintbrush | ||
CO2 Flypads | FlyStuff | 59-114 |
CO2 | Airgas | CD FG50 |
Drosophila rearing mix | ||
6 oz Square Bottom Bottles, polypropylene | Genesee Scientific | 32-130 |
Nosterile Extra Large Cotton Balls | Fisher brand | 22-456-882 |
Microscope | Olympus Corporation | SZ51 |
Drosophila Vials polystyrene | VWR international | 89092-720 |
Nosterile Large Cotton Balls | Fisher brand | 22-456-883 |
2L flask | VWR international | 89000-370 |
Petri Dishes with Clear Lids, Raised Ridge; 100 . x 15 mm; | VWR international | 25384-302 |
LB Agar, Miller | Difco | 244520 |
Innoculing Loop | VWR international | 80094-488 |
Rainin Clasic Pipettes in various sizes 0.1 µl to 2 µl, 2 µl to 20 µl, 20 µl to 200 µl, 100 µl to 1000 |
Rainin | PR-2 PR-20 PR-200 PR-1000 |
Micropipette tips (assorted sizes) | VWR international | 30128-376 53503-810 16466-008 |
Luria Broth Base, Miller | Difco | 241420 |
Disposable Culture Tubes Borosilicate Glass | VWR international | 47729-576 |
S-500 Orbital Shaker | VWR international | 14005-830 |
centrifuge | VWR international | 37001-300 |
PBS pH 7.4 10x | Invitrogen | 70011044 |
SmartSpec 3000 Spectrophotometer | Bio-Rad | 170-2501 |
Semimicrovolume Cuvettes | Bio-Rad | 223-9955 |
Vertical Capillary Puller | Kopf Needle Pipette Puller | |
3.5'' Replacement glass Capillaries for Nanojet II | Drummond Sientific Company | 3-000-203-G/X |
Nanoject II | Drummond Sientific Company | 3-000-204 |
Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 |
10mL Syringe | BD | 309604 |
Mineral Oil, White, light | Macron Fine Chemicals | 6358-10 |
minutein pins | Fine Science Tools | 26002-10 |
1.5mL Microcentrifuge tubes; Seal Rite | USA Scientific Inc. | 1615-5500 |
Motorized Pestle; Talboys Laboratory Stirrer | Troemner | 103 |
Talboys High Throughput Homogenizer | OPS Diagnostics | 930145 |
5/32'' Grinding Balls | OPS Diagnostics | GBSS 156-5000-01 |
Vortex Genie | Scientific indurstries inc. | G560 |
Multichannel Pipettor (10uL-300uL) | Sartorius | 730360 |
WASP2 Whitley Automated Spiral Plater | Microbiology International | |
ProtoCOL automated colony counter / plate counter/ plate reader | Microbiology International | |
TRIzol | Life Technologies | 15596-026 |
qPCR tubes; Low-Profile 0.2 ml 8-Tube Strips | Bio-Rad | TLS0801 |
qPCR caps; Optical Flat 8-Cap Strips | Bio-Rad | TCS0803 |
RQ1 RNase-Free DNase | Promega | m610a |
M-MLV Reverse Transcriptase | Promega | m170b |
dNTPs | Promega | U1240 |
Oligo-dT | IDT | |
SsoAdvanced SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 172-5260 |
CFX Connect Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | 185-5200 |
RNasin Ribonuclease Inhibitor | Promega | N2115 |