Telomere and telomerase play essential roles in ageing and tumorigenesis. The goal of this protocol is to show how to generate two murine inducible telomerase knock-in alleles and how to utilize them in the studies of tissue degeneration/regeneration and cancer.
الناجم عن اختلال وظيفي التيلومير فقدان النزاهة الجينوم ولها إشارات الحمض النووي من التلف المرتبطة والاستجابات عند نقاط التفتيش هي السائقين الراسخة التي تسبب تدهور الأنسجة أثناء الشيخوخة. السرطان، مع معدلات الإصابة تزداد بشكل كبير مع التقدم في العمر، يتميز أطوال التيلومير قصيرة والنشاط التيلوميراز عالية. لدراسة أدوار ضعف التيلومير والتيلوميراز تنشيط في الشيخوخة والسرطان، ويبين بروتوكول كيفية توليد اثنين التيلوميراز محرض الفئران الضربة القاضية في الأليلات 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) -inducible ثالثي مستقبلات الاستروجين (mTERT-ER) والسلمون المدخن -Stopper-السلمون المدخن TERT (LSL-mTERT). يصف بروتوكول الإجراءات للحث على ضعف التيلومير وتنشيط النشاط التيلوميراز في mTERT-ER وLSL-mTERT الفئران في الجسم الحي. وتشير البيانات إلى أن تمثيلية تنشيط النشاط التيلوميراز يمكن أن يخفف من الظواهر التنكسية الأنسجة الناجمة عن اختلال وظيفي التيلومير. في ORDإيه لتحديد تأثير التيلوميراز تنشيط على تكون الأورام، ولدت لنا البروستاتا الورم نموذج G4 PB-Cre4 PTEN L / L البروتين p53 L / L LSL-mTERT L / L والتوتة تي خلية سرطان الغدد الليمفاوية نموذج G4 أجهزة الصراف الآلي – / – mTERT ER / ER . وتشير البيانات إلى أن تمثيلية تنشيط التيلوميراز في ظل عدم الاستقرار الجيني الناجم عن اختلال وظيفي التيلومير يمكن أن يعزز إلى حد كبير تكون الأورام. يصف البروتوكول أيضا الإجراءات المستخدمة لعزل الخلايا الجذعية العصبية (NSCs) من mTERT-ER وLSL-mTERT الفئران وتنشيط النشاط التيلوميراز في NSCs في المختبر. وتشير البيانات إلى أن تمثيلية تنشيط التيلوميراز يمكن أن تعزز قدرة التجديد الذاتي وتكوين الخلايا العصبية في المختبر. وأخيرا، يصف بروتوكول الإجراءات لأداء التيلومير FISH (الإسفار في الموقع التهجين) على كلا FFPE الماوس (الفورمالين الثابتة وParafزعنفة جزءا لا يتجزأ) أنسجة المخ والكروموسومات الطورية من الخلايا المستزرعة.
التيلوميراز هو انزيم مسؤول عن الحفاظ على التيلوميرات. هذه هي متواليات المتكررة في نهايات الكروموسومات التي تحمي سلامتها. المكونات الأساسية من التيلوميراز عميم الإنزيم هي وحدة فرعية الناسخ العكسي الحفازة (TERT) وحدة فرعية RNA (TERC) التي هي بمثابة القالب لإضافة الكروموسومات يكرر 1،2. في حين قمعت بشكل عام في الخلايا الجسدية متباينة، التيلوميراز يسلك النشاط القوي ويلعب دورا هاما في الخلايا الجرثومية، والخلايا السرطانية والخلايا الجذعية.
mTERC وmTERT الفئران خروج المغلوب توفر كبيرة في نظم نموذج الجسم الحي لدراسة وظائف التيلوميراز في كل من الخلايا الجذعية والسرطان. وmTERC وmTERT خروج المغلوب لم الفئران (G1) لا تظهر أي الظواهر واضحة بسبب الاحتياطي طويل من التيلوميرات في الفئران 3. ومع ذلك، intercrossing متسلسل mTERC وmTERT الفئران خروج المغلوب إلى أواخر جيل (G5-G6) نتج عنهتآكل التدريجي للالتيلوميرات، وفي نهاية المطاف أثار تدهور حاد في الأنسجة التكاثري للغاية 4. جيل الراحل (G5-G6) mTERC – / – الفئران يعانون من العقم بسبب ارتفاع معدلات موت الخلايا المبرمج في الخصية والجرثومية نضوب الخلية. G5-G6 mTERC – / – الفئران أيضا يحمل الظواهر التنكسية في الأنسجة التكاثري للغاية بما في ذلك نخاع العظام والأمعاء والجلد بسبب ارتفاع معدلات موت الخلايا المبرمج والمعيبة قدرة التجديد الذاتي في الأنسجة الجذعية / مقصورات خلية سلفية 4. الخلايا الجذعية المكونة للدم في نخاع العظام من جيل أواخر mTERC – / – الفئران فقدان المعرض من إمكانات التكاثري، للخطر قدرة التجديد الذاتي، وتعزيز موت الخلايا المبرمج، وفي نهاية المطاف استنفاد الوظيفي 5،6. وبالمثل، لوحظت زيادة تدريجيا الهيئات أفكارك في أقبية المعوية في كل جيل من الأجيال المتعاقبة من G1-G6 mTERC – / – الفئران 7،8. تيكان تأثير ضار من التيلوميرات مختلة لا يبدو أن يقتصر على الأنسجة دوران عالية لأن كلا من انتشار الخلايا الجذعية العصبية الكبار في المختبر وتكوين الخلايا العصبية في الجسم الحي وضعف شديد في أواخر الجيل (G4-G5) mTERC – / – الفئران 9 . ويدعم دور التيلوميراز في الخلايا الجذعية مزيد من النتائج في النادر البشري عسر التقرن الخلقي اضطراب وراثي (DKC)، والتي في بعض وسائل يشبه الشيخوخة المبكرة 10،11. ويتسبب DKC بواسطة الطفرات في TERC، TERT، والجينات التي تكود dyskerin، والتيلوميراز فرعية الأساسية، وغيرها من البروتينات المرتبطة dyskerin 12. في المتوسط، التيلوميرات في المرضى الذين DKC هي أقصر من 99٪ من العمر كعينة ضابطة. ومن المقرر أن فقر الدم اللاتنسجي، والذي كان سببه الصيانة المعيبة من الخلايا الجذعية المكونة للدم الاعتلال الرئيسي لهذا المرض. جوانب أخرى للمرض مثل الطلاوة عن طريق الفم، ضمور الأظافر، retardati العقليةعلى، وضمور الخصيتين والمضاعفات الرئوية جميع أقترح ضعف وظائف الخلايا الجذعية والأنسجة الخلايا الاصلية 10، والنتائج في وثيقة الاتفاق مع تلك الموجودة في الجيل الراحل من الفئران التيلوميراز خروج المغلوب. المرضى DKC عرضة لمتلازمة خلل التنسج النقوي ويكون زيادة انتشار الأورام المخاطية الخبيثة. وهكذا، ونقص تيلوميراز في المرضى من البشر يلخص العيوب من وظائف الخلايا الجذعية والأورام الاستعداد التي لوحظت في أواخر الجيل الفئران التيلوميراز خروج المغلوب.
التيلوميرات قصيرة والنشاط التيلوميراز عالية هي السمات المميزة لمرض السرطان. كما الخلايا الطبيعية أو ما قبل سرطان تقسم، نتائج النشاط التيلوميراز منخفضة أو غائبة في تآكل في نهاية المطاف التيلوميرات وتفعيل نقاط التفتيش الخلوية مماثلة لتلك الناجمة عن الحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل فواصل (DSBs) 13. مثل DSBs الكلاسيكية، وقد تبين ضعف التيلومير للحث على البروتين p53 وما يرتبط بها من الاستجابات الخلوية، مثل الشيخوخة و / أو apoptosiق 14،15. على تعطيل طفرية من البروتين p53، وتتعزز الدراجات الخلية وبقاء الخلية في الخلايا مع ضعف التيلومير، الذي يوفر آلية mutator الموالية للسرطان التي تتميز نقل المواقع والتكبير الإقليمية والحذف 16،17. في الوقت نفسه، واصلت ضعف التيلومير وما يرتبط بها من عدم الاستقرار الكروموسومات المستشري (حتى في خلايا فارغة البروتين p53) تظهر لتقييد تطور خبيث الكامل لهذه السرطانات. على سبيل المثال، جيل أواخر G4-G5 mTERC – أظهرت الفئران انخفاضا كبيرا حدوث سرطان الغدد الليمفاوية مقارنة مع Ink4a / المنتدى الاقليمى الفئران لاغيا بسبب التيلومير الاستنزاف – / – Ink4a / المنتدى الاقليمى – /. وفي دراسة أخرى، والآفات ورميغدي أكثر تقدما في G4 mTERT – / – APC دقيقة الفئران قمعت بشكل كبير بالمقارنة مع الفئران APC دقيقة بسبب اعتقال نموا كبيرا وموت الخلايا المبرمج 18،19. الالملاحظة أن التيلومير خلل الناجم عن عدم الاستقرار الجيني يمنع تطور الورم يطالب تكهنات بأن تفعيل التيلوميراز قد تمكن تطور خبيث في جزء من قمع عدم الاستقرار الجيني إلى مستوى متوافق مع بقاء الخلية السرطانية و / أو تحييد تعتمد على البروتين p53 أو آليات تفتيش مستقلة من.
من أجل دراسة ما إذا كانت التيلوميراز تنشيط يمكن أن تتوقف أو حتى عكس الشيخوخة للخلايا الجذعية، وعما إذا كان التيلوميراز تنشيط يمكن أن تعزز تكون الأورام على خلفية عدم الاستقرار الجيني، فإننا ولدت اثنين محرض الأليلات التيلوميراز الفئران. أول واحد هو 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) -inducible ثالثي مستقبلات الاستروجين (mTERT-ER) الانصهار الضربة القاضية في أليل. في غياب 4-OHT والفئران متماثلة اللواقح بالنسبة mTERT-ER (المعين mTERT ER / ER) هي النشاط التيلوميراز ناقصة والمحافظة على نفس الظواهر الوراثية الخلوية والخلوية كما mTERT التقليدية أو مTERC نموذج خروج المغلوب. على 4 OHT العلاج، يمكن استعادة TERT-ER نشاط البروتين إلى مستويات مماثلة لالبروتين TERT الأصلي 20، 21، وأليل الثاني هو رواية TERT محرض الضربة القاضية في أليل تحتوي على intronic LoxP-سدادة-LoxP كاسيت (LSL- mTERT)؛ على استئصال LSL لجنة المساواة العرقية بوساطة، وإعادة اعرب mTERT تحت آليات الرقابة التعبير الذاتية 22.
هنا، ونحن التقرير الجيل اثنين محرض الأليلات التيلوميراز الفئران وكيفية تنشيط التيلوميراز في المجراة في المختبر. في خطوة حاسمة لإعادة تنشيط النشاط mTERT-ER هو الحفاظ على التركيز المستمر للتاموكسيفين، لذلك اخترنا لاستخدام 4-OHT الكريات الوقت الإفراج المصنعة من قبل البحوث المبتكرة الأمريكية. الكريات الحفاظ على الإفراج عن 4OHT على مستوى ثابت الدم حالة من 1 نانوغرام / مل لمدة تصل إلى 60 يوما. في دراسة سابقة، أظهرنا أن تفعيل النشاط التيلوميراز مع هذه الاستراتيجية كان قادرا على التخفيف من الظواهر التنكسية مثل استنفاد الخلايا الجذعية، وضعف الردود إصابة الأنسجة وفشل الجهاز في الأجهزة المتعددة التي تم الناجمة عن اختلال وظيفي التيلومير في G4 mTERT ER / ER الفئران 20.
البعض من دراسة وظيفة التيلوميراز في الشيخوخة، وهذين الأليلات التيلوميراز محرض يمكن أن تستخدم أيضا لدراسة السرطان. أخذت الدراسات السابقةالاستفادة من هذه الأليلات لاستكشاف دور الاستنزاف التيلومير والتيلوميراز تنشيط في تشكيل الجينوم والتي تؤثر بيولوجيا الخلايا T-سرطان الغدد الليمفاوية الغدة الصعترية 21 وسرطان البروستاتا 22. وأظهرت هذه الدراسات أن اثنين من اختلال وظيفي التيلومير في جيل أواخر G4 أجهزة الصراف الآلي – / – mTERT ER / ER وG4 PB-Cre4 PTEN L / L البروتين p53 L / L LSL-mTERT L يوفر / L الفئران آلية تأجيج اكتساب الأحداث مطفرة مبكرة ل بدء الورم، ولكن منع تطور الأورام الخبيثة بشكل كامل. عندما تم تنشيط التيلوميراز في سياق الناجم عن خلل وظيفي-التيلومير عدم الاستقرار الجيني، ونقاط التفتيش الحمض النووي من التلف وتفشي عدم الاستقرار الكروموسومات قمعت، والذي سمح للتطور الكامل للأورام الخبيثة مع الخصائص البيولوجية الجديدة مثل الانبثاث العظام سرطان البروستاتا 21 وتسلل دماغ التوتةج سرطان الغدد الليمفاوية 21. وقد لوحظت ظواهر مماثلة أيضا في أنواع السرطان الأخرى بما في ذلك سرطان القولون وسرطان البنكرياس (الاتصالات الشخصية مع الدكاترة. Haoqiang يينغ، آدم Boutin ورونالد DePinho).
لأن البروتين TERT-ER يمكن ان يكون مثبت بسهولة بين داخل وخارج الدول اعتمادا على ما إذا تعامل الحيوانات مع تاموكسيفين أو مركبة، ونماذج ورم الناتجة عن mTERT-ER أليل يمكن استخدامها لاختبار العلاج المضاد للالتيلوميراز. في دراسة سابقة، والأورام ولدت في G4 أجهزة الصراف الآلي – / – أطلق سراح mTERT ER الحيوانات / ER من 4 OHT. على استنزاف التيلوميراز، تقلصت الأورام في نهاية المطاف بسبب إعادة التيلومير التي يسببها خلل نقاط التفتيش 21. ومع ذلك، فإن بعض الأورام المكتسبة المقاومة ردا على التيلوميراز الانقراض من خلال تفعيل لتطويل البديل من التيلوميرات (ALT) آلية. أظهر المزيد من توصيف هذه الأورام ALT + مقاومة أن ريا لها النسخ الشاذة من الجينات المسؤولة في علم الأحياء الميتوكوندريا والدفاع الأكسدة بما في ذلك منظم سيد الميتوكوندريا التوليف والاكسدة الدفاع PGC-1β. ضربة قاضية من PGC-1β أو SOD2 (منظم آخر للدفاع الأكسدة) يلغي بشكل كبير ALT + ورم خلايا بينما تبقي تبقى التيلوميراز + ورم خلايا سليمة نسبيا 21.
القيد واحد من هذين الضربة القاضية في الأليلات هو أنها يمكن أن تحمل فقط تنشيط التيلوميراز على مستوى الذاتية لأنهم في موضع الأصلي للجين التيلوميراز. في معظم السرطانات البشرية، هى overexpressed التيلوميراز في الواقع على مستوى أعلى من ذلك بكثير. من أجل تعزيز مستوى التيلوميراز، وتعديل واحد يمكن أن نعتبر هو لإدراج بناء mTERT-ER مع المروج أقوى مثل PGK (فسفوغليسرات كيناز) المروج في Rosa26 مكان.
وفي الختام، توفر هذين جديدة محرض الأليلات التيلوميراز الفئران جينيه لم يسبق له مثيلأدوات جيم لدراسة وظائف التيلوميراز في الشيخوخة وتوازن الأنسجة وكذلك تطور الورم، خصوصا في ظل خلفية من الحصول عليها قبل التيلومير التي يسببها خلل عدم الاستقرار الجيني. ويمكن أيضا أن أليل mTERT-ER أن تستخدم لدراسة العلاج المضاد للالتيلوميراز عن طريق عبور إلى أخرى نماذج الماوس عرضة للورم.
The authors have nothing to disclose.
J.H. is supported by NIH K99/R00 Pathway to Independence Award (5K99CA172700) and NCI Brain Cancer SPORE Career Development Award (2P50CA127001).
Leica AM6000 Micromanipulation Kit | Leica | Per quote | |
Leica DMI6000 B inverted microscope | Leica | Per quote | |
Neomycin | Life technologies | 21810031 | |
isoflurane vaporizer | Veterinary Anesthesia Systems | 911103 | |
isoflurane | Henry Schein | 1005796 | |
ketamine-xylazine mixture | Sigma-Aldrich | K113-10ML | |
4-OHT powder | Sigma-Aldrich | H7904-5MG | |
Tamoxfien | Sigma-Aldrich | T5648-1G | |
4-OHT pellet | Innovative Research of America | Custermized | |
Precision Trochar (10 Gauge) | Innovative Research of America | MP-182 | |
wound clip applier | Fischer Scientific | 01-804 | |
clip | Fischer Scientific | 01-804-5 | |
Neural Tissue Dissociation Kit | Miltenyi Biotec | 130-092-628 | |
HBSS | Life technologies | 14025092 | |
PBS | Life technologies | 10010023 | |
xylene | Fischer Scientific | X3P-1GAL | |
methanol | Fischer Scientific | A-433S4 | |
acetic acid | Fischer Scientific | A38-500 | |
ethanol | Fischer Scientific | 22-032-104 | |
formamide | Fischer Scientific | F84-1 | |
PNA telomere probe | Panagene | F1001-5 | |
PNA centromere probe | Panagene | F3003-5 | |
20X SSC | Fischer Scientific | BP1325-4 | |
BSA | Sigma-Aldrich | A2153-10G | |
tRNA | Sigma-Aldrich | R5636-1ML | |
Tween 20 | Fischer Scientific | BP337-100 | |
rubber cement | Walmart | Elmer's | |
DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 |