הכנה חדשה vivo לשעבר הדמיה חוט השדרה העכבר. פרוטוקול זה מאפשר לשני פוטונים הדמיה של אינטראקציות הסלולר בשידור חי בכל רחבי חוט השדרה.
Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for live-cell imaging in the murine spinal cord. This technique is uniquely suited to analyze neural precursor cell (NPC) dynamics following transplantation into spinal cords undergoing neuroinflammatory demyelinating disorders. NPCs migrate to sites of axonal damage, proliferate, differentiate into oligodendrocytes, and participate in direct remyelination. NPCs are thereby a promising therapeutic treatment to ameliorate chronic demyelinating diseases. Because transplanted NPCs migrate to the damaged areas on the ventral side of the spinal cord, traditional intravital 2P imaging is impossible, and only information on static interactions was previously available using histochemical staining approaches. Although this method was generated to image transplanted NPCs in the ventral spinal cord, it can be applied to numerous studies of transplanted and endogenous cells throughout the entire spinal cord. In this article, we demonstrate the preparation and imaging of a spinal cord with enhanced yellow fluorescent protein-expressing axons and enhanced green fluorescent protein-expressing transplanted NPCs.
מודלים עכבר של demyelination, כוללים Encephalomyelitis הניסיוני אוטואימוניות (EAE) וזיהום תוך-גולגולתי עם וירוס צהבת עכבר neuroadapted (MHV), הם כלים מצוינים ללמוד מסלולים מולקולריים ואינטראקציות הסלולר הקשורים במחלה. הם הובילו ולתמכו ביעילות של ה- FDA אישרה טיפולי תרופות, בעיקר מיקוד הפסקת אוטואימוניות ודלקת 1. עם זאת, ברגע שחידוש יצירת המיאלין אנדוגני נכשל, הטיפולים שאושרו כרגע לא ביעילות לתקן נגעי demyelinated במערכת העצבים המרכזית. לכן, טיפולים ממוקדי תיקון בשלב זה של מחלה הם קריטיים להקלת סימפטומים כרוניים ושיפור איכות החיים. לאחרונה, תאים עצביים מבשר (NPCs) הגיעו לחזית ככלים טיפוליים משובי פוטנציאל להתמקד באזורים של דלקת ופגיעה במיאלין. מספר מחקרים הדגישו את היכולת של NPCs כדי לגרום endogenoשלנו חידוש יצירת המיאלין ולהשתתף באופן ישיר בחידוש יצירת המיאלין 2-8. בגלל NPCs מעורב בחידוש יצירת המיאלין ישיר, זה הכרחי כדי להבין קינטיקה ויחסי הגומלין שלהם עם תאי אנדוגני לאחר השתלה. לאחר השתלה, NPCs להעביר ventrally לאזורי נזק בחומר לבן, אז rostrally וcaudally ביחס לאתר ההשתלה 5,9. קינטיקה של הגירה שונה בתגובה לרמזים סביבתיים; יש NPCs הושתלו בעמוד השדרה פגוע שאינן מהירויות גדולות יותר מNPCs הושתלו בעמוד השדרה ניזוק 6. לאחר תקופה נודדת, הועבר NPCs להתרבות בהרחבה, בשיעור גבוה יותר בהשוואת חוט השדרה פגועה לחוט השדרה שלם 6. לבסוף, רוב NPCs להתמיין oligodendrocytes וליזום 4,6,9 חידוש יצירת המיאלין ישיר.
נגע demyelinated הוא מורכב ויכול לכלול אוכלוסייה מגוונת של תאים בשלבים שונים שלctivation. לדוגמא, נגע פעיל בטרשת הנפוצה (MS) עשוי לכלול אוכלוסייה משמעותית של תאים מופעלים T, מיקרוגליה M1 ומקרופאגים M1, אבל נגע MS שקט כרוני יכול להיות מורכב בעיקר של האסטרוציטים תגובה עם כמה תאים דלקתיים 10-13. בגלל המגוון של תאי מפעיל, הדמיה שני פוטונים (2P) במודלים של עכברים של demyelination היא כלי מאוד שימושי שיעזור להבין אינטראקציות הסלולר מקומיות בנגע. בטרשת נפוצה ומודלי מחקר MS שימוש נרחב רבים, רוב הנגעים נמצאים בצד הגחון של חוט השדרה, באזור שאינו נגיש להדמית 2P intravital בשל עומק נגע ותוכן שומנים הגבוה של חוט השדרה. כדי לעקוף בעיות אלה ואינטראקציות תא-תא מחקר בנגעים לאורך חוט השדרה הגחון פיתחנו לשעבר הכנת ההדמיה vivo 2P 6 פשוט.
מחקר זה עוקב אחר פרסום שיטות קודם, אשר הראההליך השתלת חלבון משופר ירוק ניאון (eGFP) NPCs -expressing לחוט השדרה של עכברים הבאים מתח JHMV של demyelination המושרה MHV 14. עכברים בן חמישה בשבוע שנגועים בJHMV ומושתל עם eGFP-NPCs ברמת בית החזה 9 ביום 14 לאחר פגיעה. הפרוטוקול המובא כאן מספק את צעדים מפורטים כיצד לחלץ את חוט השדרה, לעשות הכנת vivo לשעבר agarose, ואינטראקציות eGFP-NPC תמונה מושתלת עם חלבון משופר צהוב ניאון (EYFP) האקסונים -expressing. עכברים להביע EYFP תחת אמרגן Thy1 העצבי ספציפית שמשו בהליך זה 15. רק חלק מהאקסונים להביע EYFP, מה שהופך אותו לשימושי הדמיה אקסונים בודדים. כאן אנו מראים מיתרי השדרה הוסרו בשעה 7 ימים לאחר השתלה; עם זאת, ניתן לחלץ מיתרי השדרה בכל נקודת זמן לאחר השתלה. אמנם אנו מציגים אינטראקציות של NPCs עם אקסונים פגועים, הפרוטוקול שלנו יכול לשמש בשילוב עם סמני ניאון גנטייםשל סוגי תאים אחרים כדי לחקור מספר רב של אינטראקציות הסלולר מתרחשות ברחבי חוט השדרה העכבר.
בזמן אמת 2P הדמיה של רקמות שלמות נדרשת לחקור קינטיקה NPC ואינטראקציות לאחר השתלה לתוך חוט השדרה עכבר demyelinated. ההדמיה Intravital 2P משמשת בדרך כלל כדי לקבוע דינמיקה סלולרית בצד הגבי של חוט השדרה בעכברים חיים, ונעשתה בו שימוש כדי ללמוד demyelination הגב בdemyelinating המחלה 17-19. עם זאת, …
The authors have nothing to disclose.
This work was supported in part by National Institutes of Health (NIH) Grants R01 GM-41514 (to M.D.C.), R39 GM-048071 (to I.P.), and R01 NS-074987 (to T.E.L.) and the National Multiple Sclerosis Society (NMSS) Collaborative Center Research Award CA1058-A-8 (to C.M.W., T.E.L. and M.D.C.), NMSS Grant RG4925, NIH Training Grant T32-AI-060573 (to M.L.G.), NMSS Postdoctoral Fellowship FG 1960-A-1 (to J.G.W.), and funding from the George E. Hewitt Foundation for Medical Research (M.P.M.).
Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Isoflurane, USP | Piramal Critical Care, Inc | N/A | |
Fine scissors | Fine Science Tools | 14060-09 | sharp |
scalpel blade #10 | Fine Science Tools | 10010-00 | |
scalpel handle | Fine Science Tools | 10003-12 | |
Luer rongeurs | Fine Science Tools | 16001-15 | |
Graefe forceps | Fine Science Tools | 11052-10 | |
Vannas scissors | Fine Science Tools | 15615-08 | |
scalpel blade #11 | Fine Science Tools | 10011-00 | |
RPMI-1640 | Gibco | 12-115F | |
agarose, low gelling temperature | Sigma | A9414-25G | |
Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-12 | |
Vetbond (tissue adhesive) | 3M | 1469SB | |
22 mm square cover slip | Fisher Scientific | 12-547 | |
25x dipping objective, 1.1 NA | Nikon | CFI Apo LWD 25XW | |
Single inline solution heater | Warner Instruments | 64-0102 | |
520 nm single-edge dichroic beam splitter | Semrock | FF520-Di02-25×36 | Brightline |
560 nm single-edge dichroic beam splitter | Semrock | FF560-FDi01-25×36 | Brightline |
photomultiplier tubes | Hamamatsu | R928 | |
C/L variable-speed tubing pump | Masterflex | 77122-22 | |
digital thermometer | Comar Instruments | 3501 | |
Chameleon Ultra Ti:Sapphire laser | Coherent | N/A | |
Slidebook 6 software | 3i | N/A | |
Imaris 7.7 software | Bitplane | N/A |