도설 신경절 (DRG)은 말초 신경계의 감각 뉴런을 포함하는 구조이다. 해리 된 때, 그들은 손상 부위에서 생체 내 환경을 모방 관내 신경 재생과 수초 형성을 연구하는 유용한 모델을 제공하고, SC 형 지방 유래 줄기 세포 (ASC)와 함께 공동 배양 될 수있다.
Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the study of nerve regeneration and myelination. The glial cells of the peripheral nervous system, Schwann cells (SC), are key facilitators of these processes; it is therefore crucial that the interactions of these cellular components are studied together. Direct contact between DRG neurons and glial cells provides additional stimuli sensed by specific membrane receptors, further improving the neuronal response. SC release growth factors and proteins in the culture medium, which enhance neuron survival and stimulate neurite sprouting and extension. However, SC require long proliferation time to be used for tissue engineering applications and the sacrifice of an healthy nerve for their sourcing. Adipose-derived stem cells (ASC) differentiated into SC phenotype are a valid alternative to SC for the set-up of a co-culture model with DRG neurons to study nerve regeneration. The present work presents a detailed and reproducible step-by-step protocol to harvest both DRG neurons and ASC from adult rats; to differentiate ASC towards a SC phenotype; and combines the two cell types in a direct co-culture system to investigate the interplay between neurons and SC in the peripheral nervous system. This tool has great potential in the optimization of tissue-engineered constructs for peripheral nerve repair.
말초 신경 손상은 영국에서 약 9,000가지 경우는 주로 젊은 매년 발생하고 인구 1 일에 일반적이다. 미세 수술 신경 수리 기술에도 불구하고, 기능의 정상 회복이 손상 손 감각, 감소 된 운동 기능과 잦은 통증과 감기 편협 2 결과와 얻기 어려운 것입니다. 이러한 부상은 심오하고 영구적 인 환자에 미치는 영향과 60 % 미만이 3 일 반환과, 일상 생활의 활동을 수행 할 수있는 능력을 가지고있다.
부상, 표현형 및 신경 세포의 형태와 슈반 세포 축삭 발아 수있는 적합한 환경을 만들기 위해 (SC)의 변화에 따라. 절단 한 경우에는 신경 근위 및 원위 덩어리들로 분할되고; 회생 절차가 말초 그루터기 동안, 발생하는 지점 인 근위 그루터기는 SC의 분리 그러자 Wallerian의 변질부상 축삭, 드 차별화 증식에서. 이것은 미엘린 파편을 제거하고 신경 재생성 4,5- 대한 원위 루터 제조 향해 기본이다. 축삭의 발아는 말초 그루터기에서 SC가 발표 한 신경 영양 요소와 케모카인의 생산에 의해 지원 및 Wallerian 변성 6,7 다음 남겨 기저판에 의해 인도된다. SC는 Büngner의 밴드를 형성하는 재생 축삭, 나란히 정렬하는 원조 endoneurial 튜브 외부 분기 감소 대상 기관으로 축삭의 성장. reinnervation 다음, SC는 재생 된 축삭 포장 새로운 수초를 형성하지만, 감각과 운동 기능을 부분적으로 만 8 복원됩니다.
배근 신경절 (DRG)는 감각 신경 세포가 주변 장기에 분포 포함하는 척추의 척추 사이 구멍에있는 구조이다. 해리 된 때, 그들은 적합한 시험 관내 개조로서 사용될 수있다수초 형성의 조사를 포함하여 11 일 – 신경 재생 (9)의 연구를위한 엘. 특히, 성인 DRG 뉴런은 이러한 세포의 생체 내 특성을 모방 및 조직 공학에서 말초 신경 수리를 위해 새로운 전략을 연구하는 강력한 도구를 제공합니다.
공동 배양은 시험관 내에서, 특히 두 개 이상의 세포 유형의 생체 내 상호 작용 환경을 시뮬레이트 동적 시스템을 나타낸다. 이들 세포 공동 배양 모델의 장점 중 하나는 세포 외 환경에 작용 될 수있는 유연성과 높은 제어이다. 14 – DRG 뉴런은 말초 신경계 (10,12)의 두 세포 형 사이에 발생하는 실제의 상호 작용을 모방하는 SC와 공동 배양 시스템에서 자주 사용되어왔다. 이는 SC는 세포 외 기질 (ECM) 단백질과 현저하게 개선 할 수 성장 인자를 분비하는 것으로 입증되었다DRG 뉴런의 능력은 생존과 신경 돌기를 15, 16 새싹합니다. 그러나, SC는 세포 배양 기술의 발전에도 불구하고, 그것을 조직 공학 어플리케이션에 적합한 세포 수를 생성하기 위해 여전히 어렵고, 증식, 긴 시간을 필요로하고. 또한, 건강한 신경의 희생자가 SC 수확 필요로한다. 따라서 소싱 SC의 차이는 두 조직 공학 및 신경 재생의 시험 관내 시험에서 중요하다. 이러한 관점에서, ASC는 말초 신경 17,18 수리에 사용되는 조직 공학적 구조의 개발을위한 유용한 대안으로 간주 될 수있다. 이전 작업은 S-100, P75 및 신경교 원 섬유 성 산성 단백질 (GFAP) (19)뿐만 아니라, 미엘린 단백질 제로 (P0)와 같은 특성 신경교 – 마커 (20)를 발현하는, SC 형 ASC로 분화하는 이러한 세포의 능력을 입증 . 뇌 유래 신경 영양 인자로서 신경교 성장 인자의 분비 (BDNF)은 신경 성장 인자 (NGF) 및 아교 세포 유래 신경 영양 인자 (GDNF)도 21, 22을 관찰 하였다. 26 – 시험관 내에서 모두에 의해 입증 및 생체 내에서 23 일 연구 따라서, SC 형 ASC는, 말초 신경 재생의 프로모터로서 사용될 수있다. 또한, ASC는 다른 줄기 세포 유형에 비해 더 많은 수의 최소 침습 절차를 수확 할 수있다; 지방 조직에서 줄기 세포의 빈도는 100- 골수 (27)보다 1000 배이며, 이들은 SC 골수 간엽 줄기 세포에 비해 더 높은 증식률을 갖는다.
이 작품은 각각 해리 DRG 뉴런과 ASC의 고효율 수확을 수행하기위한 세부 프로토콜, 후자는 SC-유사 세포로 분화되는 것을를 제공하는 것을 목표로하고있다. 이러한 두 종류의 세포 공동 배양 따라서 DRG 네브라스카의 능력에 대한 추후 연구에 사용될 수있는 매우 실용적인 시스템을 제공하는 것이다urons는 신경 돌기 신경 조직 공학에 대해 서로 다른 발판에 수초 형성의 메커니즘을 새싹합니다.
차 문화가 생체 내에서 axotomy 후 신경 세포의 재생을 연구하는 DRG 뉴런은 자주 신경 세포들 사이에서 사용된다. 여기에서 성인 쥐 DRG 수확 정확한 프로토콜 뉴런 생존을 손상시키지 않고 주변 환경 위성 세포 집단을 줄이는 목적으로 제시된다. SC-같은 표현형로 분화 ASC으로 세포 치료에 대한 SC에 대한 유효한 대안, SC-같은 ASC / DRG 공동 문화 시스템은 상세하게 설명한다.
33 – 널리 라미닌 (또는 라미닌 유래 펩티드 서열) 신경 세포의 생존 및 신경 돌기의 형성 (31)에 유익한 영향을 미칠 것으로 알려져있다. DRG 신경 세포 배양을 수행 할 때 이것은 따라서 신경 세포의 기능의 손실을 방지하기 위해 이전에 코팅 라미닌 각각의 기판을 의뢰한다. 라미닌 코팅의 개념은 또한 설계를위한 기판을 생체에 적용예컨대 폴리 조직 공학 구조물, – 카프로 락톤 (PCL)은 자주 신경 도관 (30)의 제조에 사용된다. 또한, 이전의 연구는 섬유소 행렬은 세 가지 차원 (11)의 연결을 문화에 적합한 물질이라는 것을 보여 주었다.
단백질 코팅 외에도 공동 배양 모델 DRG 신경 세포의 생존과 손상 후 말초 신경계에서 신경 및 SC 사이에 발생하는 상호 작용을 연구하기위한 가치있는 적합한 환경 조건을 제공한다. 세포는 손상 부위에서자가 세포의 모집 시간을 단축하기 위해 신경 디바이스를 사용하여 생체 내에서 이식 될 수있다. 이 세포 노화 / 죽음과 근육의 위축으로 이어질 수 있습니다 심각한 부상에서 특히 중요하다. SC는 말초 신경 재생과 수초, 제한된 가용성 및 느린 확산 속도의 과정에 관여하는 가장 중요한 신경 교세포 있지만 이들에 부적합하게조직 공학 응용 프로그램 (34). ASC는 그들의 풍부하고 SC 표현형으로 분화 할 수있는 능력, 특정 아교 세포 마커를 발현 및 기본 SC 19 기능적 유사성을 보여주는에 유효한 대안이다. ASC는 공존 배양 시스템에 의한 DRG 뉴런 형성 및 신경 돌기의 연장에 도움이 될 수있는 단백질, 성장 인자 5를 생산할 수있다. 그러나, 두 개의 서로 다른 공동 문화 시스템은 실험의 요구 기능으로 설정할 수 있습니다. 본 논문에서 제안 된 방법은 실험실 11 노포 프로토콜 개정판이며 제 2 셀 타입 (DRG 뉴런)이 시딩되는 두 세포 형 사이에 직접 접촉 (직접 공 배양)를 포함 기타 (SC 형 ASC)의 위에. 이 접근법은 신경 세포 배양 물 (35)을 시드 때 기판상의 폐해 전지 층의 존재의 중요성을 입증 이전 연구 결과에 기초 <sup> – (37). 이 효과는 줄기 세포 표면에서 ASC 및 다른 큐들로부터 증착 DRG 인테그린을 통하여 세포 – 세포 상호 작용 및 ECM 분자로 인한 것 같다. 또한 매체에있어서 혈청 단백질의 감소는 ASC 기능에 영향을주지 않고, DRG 뉴런의 해리로부터 도출 할 수 위성 세포 오염의 확산을 감소하는 것이 관찰되었다. 그러나, SC의 작은 집단을 포함 위성 셀들은, 또한 완전히 공동 배양 시스템 존재할 것이다 DRG 뉴런 거의 남은 세포 배양 물로부터 제거하기 어렵다. 이들 작은 하위 집단은 또한 손상 후 생체에 존재하는자가 세포를 회수하고, 체외 공부하는 동안 수초 프로세스에 참여할 수 있습니다하는 것이 중요하다. 두 번째 방법 (여기서 제시되지 않음) 개의 상이한 세포 유형 간의 직접 접촉 (간접 공 배양)을 피하고, 세포 배양 인서트의 사용을 포함한다. HowevER, 이는 신경 재생 (긴 신경 돌기를 개발하는 신경 세포의 능력이 감소) 중 생체 조건의 반영하지 않고 있지만, 다른 (38) 상에 소정의 세포 집단에 의해 배지에서 방출 확산 성 요인의 영향을 조사하기 위해 사용되는 .
The authors have nothing to disclose.
This work is supported by the National Institute for Health Research, Academy of Medical Sciences and the British Society for Surgery of the Hand. We also gratefully acknowledge the continuing supply of GGF-2 from Acorda Therapeutics, USA. The authors would finally like to acknowledge Prof. Giorgio Terenghi for his valuable support and guidance in our group over the past years that led to the development and optimization of this protocol.
Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
100 µm cell strainer | BD Biosciences | 352360 | 70 μm strainers (ref. 352350) can be used as alternative |
15 mL plastic tubes | Sarstedt | 62.554.002 | |
50 mL plastic tubes | Sarstedt | 62.547.004 | |
75 cm2 flasks | Corning | BC301 | |
Retinoic Acid >98% HPLC | Sigma | R2625 | |
ARA-C supplement | Sigma | C6645 | |
Recombinant Human FGF-basic (154 aa) | Peprotech | 100-18B | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A9205 | |
Collagenase type I | Gibco | 17100-017 | Note: this collagenase is only used for fat tissue digestion |
Collagenase type IV | Worthington Biochemical | LS004188 | Note: this collagenase is only used to dissociate DRG explants |
Foetal Bovine Serum (FBS) | Biosera | FB-1001 | |
Forskolin | Sigma | F3917 | |
Glass pipettes | Fisher Scientific | FB50253 | Sharp material to be disposed accordingly |
Glial Growth Factor-2 (GGF-2) | Acorda Therapeutics | GGF-2 was kindly donated by Acorda Therapeutics. For a commercially available alternative, we recommend NRG1-β1 (R & D Systems, Abingdon) for stem cell differentiation to be used at the final concentration of 200ng/ml | |
Nutrient Mix F12 HAM | Sigma | N6658 | Warm at 37 °C in a water bath unless specified |
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Sigma | H9394 | Warm at 37 °C in a water bath unless specified |
N-2 supplement (100x) | Invitrogen | 17502 | |
Nerve Growth Factor 2.5s Protein, Mouse Submaxillary Glands (NGF) | Millipore | NC011 | |
Penicillin-Streptomycin (PS) | Sigma | P0781 | |
Petri dishes | Corning | 430165 | |
Recombinant Human PDGF-AA | Peprotech | 100-13A | |
Trypsin | Invitrogen | 25200-056 | Warm at 37 °C in a water bath. This is used for cell detachment from tissue culture flasks |
Trypsin (2x bovine pancreatic) | Worthington Biochemical | LS003703 | This is used for DRG dissociation |
Minimum Essential Medium Eagle (MEM) | Sigma | M8042 | Warm at 37 °C in a water bath unless specified |
2-mercaptoethanol | Sigma | M3148 | Prepare the solution in the biological cabinet |