This protocol describes NAME, an assay that allows the rapid identification of molecules able to inhibit in vitro the chaperone activities of HIV-1 nucleocapsid protein.
РНК или ДНК складывают стабильной трехмерной складывания интересные цели в разработке противоопухолевых или противовирусных препаратов. В случае ВИЧ-1, вирусные белки, участвующие в регуляции вирусной активности распознать несколько нуклеиновых кислот. Нуклеокапсид белок NCp7 (NC) является ключевой белок регулирования несколько процессов в ходе репликации вируса. NC на самом деле компаньонка дестабилизации вторичных структур РНК и ДНК, и облегчение их отжига. Инактивация ЧПУ новый подход и интересной мишенью для терапии анти-ВИЧ. Н ucleocapsid nnealing- М ediated Е lectrophoresis (имя) был разработан анализ для идентификации молекул, способных ингибировать плавление и отжиг РНК и ДНК, сложенный термодинамически стабильных трехмерный конформации, например, шпильки структур смолы и cTAR элементов ВИЧ, путем нуклеокапсида белков ВИЧ-1. Новый анализ использует либо повторноcombinant или синтетический белок, и олигонуклеотиды, без необходимости их предыдущего маркировки. Анализ результатов достигается за счет стандартного электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ) с последующим обычным окрашивания нуклеиновой кислоты. Протокол сообщил в этой работе описывается, как выполнить имя анализа с полноразмерного белка или его усеченной версии не хватает основной N-концевой домен, как компетентный, как нуклеиновые кислоты сопровождающих, и как оценить ингибирование шаперонов деятельности НК по резьбы интеркалятора. Кроме того, имя может быть выполнена в двух различных режимах, полезно получить указания на предполагаемого механизма действия определенных ингибиторов с ЧПУ.
Нуклеокапсид белок NCp7 (NC) вируса иммунодефицита человека типа 1 (ВИЧ-1) представляет собой небольшой, основной белок, который тесно связанный с геномной РНК в зрелом инфекционного вируса, играя ключевую роль в репликации вируса в качестве кофактора во время обратной транскрипции признание генома, и упаковка. 1-3 NC действует как шаперона нуклеиновых кислот, катализирующего дестабилизации стабильных структур нуклеиновых кислот и отжиг комплементарных последовательностей. Его нуклеиновой кислоты агрегирования активность находится в основном в 11 аминокислот N-концевой домен, а дуплекс дестабилизации активность была отображается на его цинковых пальцев структур (12-55 пептид). 4 положительно заряженный белок снижает электростатический барьер реакции отжига и увеличивает скорость, с которой два отдельных комплементарные последовательности собрались.
Нуклеиновые кислоты сложенные в стабильном конформации требуют сопровождающего деятельность ЧПУ на facilitatе их отжига 5 Это особенно важно в обратном транскрипции, в котором ЧПУ имеет решающее значение в событиях перенос цепи:. в передаче минус нити, минус цепь ДНК, остановки, только retrotranscribed, должны быть переданы, и отожженного с комплементарной последовательностью в области R в 'конце РНК-генома 3 шаблона. 6 Хотя термодинамически выгодным, эта реакция не происходит широко в отсутствие NC-за наличия стабильной структуры транс активации реагировать района (ТАР) РНК в регионах R, которые должны быть связаны с его ДНК-копии (cTAR ДНК). 7 cTAR и TAR, на самом деле, хорошо структурированный регионов с характерным Шпилька конформации. NC белка денатурации эти шпильки, а также способствует минус-нить передачу, увеличивая скорость межмолекулярного отжига между комплементарными нитями нуклеиновых кислот. Механизм НК отжига смолы и cTAR была тщательно исследована и де-описано, как деготь отжига анализа в нескольких научно-исследовательских работ и предложенная схема изображена на отличные отзывы. 8-11 Подводя итог, NC дестабилизирует вторичную структуру стабильной РНК, таких как TAR-РНК, дестабилизирует вторичную структуру ее комплементарной последовательностью, cTAR-ДНК и способствует реакции отжига РНК / ДНК, ведущую к TAR / cTAR гетеродуплексным формирования. 10,11 В результате шаг нити переноса в процессе репликации ВИЧ способствует. 12
NC является привлекательной мишенью для разработки новых противовирусных средств, так как потенциальные помехи, индуцированный небольших молекул по отношению к NC приведет к уменьшению обратной транскрипции вирусного генома, как следствие под угрозу активности НК. 2,13 Такой подход может в конечном счете, привести к развитию успешных анти-ВИЧ агентов. В ходе скрининга для ЧПУ ингибиторы 14 мы разработали анализ, опираясь на хорошо известных свойствнуклеокапсидного эффективно дестабилизировать и отжига комплементарных олигонуклеотидов. 10,11 Мы назвали это N ucleocapsid nnealing- M ediated E lectrophoresis (имя) анализа. НАИМЕНОВАНИЕ анализе используют NC опосредовать отжиг между шаблоном стабильно копий дополнительных нуклеиновых кислот, в нашем случае олигонуклеотида, соответствующего апикальной части последовательности ТАР-РНК с ее комплементарной последовательностью ДНК (cTAR) с получением гибридом смолы / cTAR гетеродуплекс , Анализ TAR cTAR реакции / отжига в присутствии НК могут быть исследованы с помощью электрофореза родной полиакриламидном геле (ПААГ).
Этот протокол показывает, как выполнить имя анализа для быстрого отжига при комнатной температуре олигонуклеотидов сложенными в стабильных шпильки структур, как анализировать результаты реакции и возможного устранения неполадок эксперимента. Радиоактивное мечение нуклеиновой кислоты не требуется, и Детективна олигонуклеотидных полос могут быть выполнены с помощью обычных методов окрашивания. Анализ, который использует либо рекомбинантный белок полной длины или укороченный синтетический вариант NC, позволяет идентифицировать заправки интеркаляторами ингибирующих NC, деятельность коррелирует с сильным связыванием с ДНК и РНК. 14
NAME является анализ, который позволяет быстро оценить ингибирование шаперонов деятельности нуклеокапсидного белка ВИЧ-1, интересным объектом в поисках новых лекарств против ВИЧ. NC отжигов быстро и при комнатной температуре в нуклеиновых кислот которых стабильно складывающиеся в противном случае требуют термической денатурации при высокой температуре с последующим тщательным отжигом. Анализ может быть выполнен либо с полной длины NC или усеченной (12-55) NC: в обоих случаях два нуклеиновые кислоты (РНК и ее комплементарной копии ДНК) быстро отжигу. Это согласуется с наблюдением литературы с укороченной NC пептида: отжига инициируют эффективного плавления ствола cTAR последующим взаимодействием ее комплементарной апикальной петли, которая является слабым NC сайт связывания с комплементарной последовательностью смолы апикальной петли, в конечном итоге через несколько нестабильных промежуточных к расширенному отожженном гибрид. 21
NC является очень стабильным протEin и некоторые проблемы при выполнении название могло произойти. Это очень важно, однако, чтобы добавить свежеприготовленные SDS в геле Загрузка буфер, используемый для остановки реакции: если это не достигнуто, гель не будет показывать полосы нуклеиновых кислот в правильной позиции. В самом деле, NC представляет собой белок, нуклеиновая кислота связывания, таким образом, чтобы правильно визуализировать смолы / cTAR гетеродуплекс с помощью гель-электрофореза SDS должен присутствовать в геле загрузочным буфером для денатурации белка и освободить ее из плотного комплекса с нуклеиновыми кислотами. Это также возможность устранения ошибок эксперимента, т.е. формирование сдвинутых полос в течение гель перспективе. Этот эффект особенно очевиден, когда был использован в полный рост НК, как показано на рисунке 2, и связан с наличием высокой базовой N-концевой хвост, имеющий сильное влияние на сводной нуклеиновых кислот.
Наличие терминала основного хвоста делает реакцию отжига труднее быть подавлено, как показанон на рисунке 3 с использованием соединения 1, представитель резьбы интеркалятором, т.е. интеркалятором особенно эффективны при стабилизации Шпилька структуры смолы и о cTAR. На самом деле, этот тип взаимодействия с нуклеиновыми кислотами способствует при выпуклости и петли прерывания непрерывности двойной спирали, что обеспечивает более простой резьбы из объемных заместителей в пар оснований. Стабилизация смолы и cTAR этими связующими нуклеиновых кислот была ранее анализировали с помощью определения повышения температуры плавления двух олигонуклеотидов. 14 Кроме того, увеличение температуры плавления коррелирует с ингибированием отжига, катализируемой ВИЧ-1 NC, что приводит к снижению образования гетеродуплекса TAR / cTAR и о том, что резьбы интеркаляторы являются интересным классом связующих для динамических структур РНК, таких как TAR элемента. 14
Механизм действия вызывается для этих компоunds может быть дополнительно подтверждено путем выполнения анализа названием в различных альтернативных форматов, как показано на рисунке 4: в случае интеркаляторов ингибирование отожженного гетеродуплексе усиливается, когда препарат инкубируют с двух сложенных олигонуклеотидов. Соединения, действующие с разным механизмом действия, такие как прямое связующих белка НК, будет меньше, зависит от различных режима предварительной инкубации. ИМЯ анализ выполняется в двух методов, поэтому могут быть использованы для скрининга библиотек соединений для выявления ингибиторов ЧПУ, а также для оценки Вероятный механизм действия положительных хитов, ища анти-ВИЧ препаратов, направленных на NC. Очевидно, что использование только этих методов при обращении к конкретным механизмом действия, определенных ингибиторов с ЧПУ не является достаточным, и другие подходящие биохимические анализы необходимы, чтобы поддерживать рабочую гипотезу. 14
Наконец, следует подчеркнуть, что имя используется в высшей степениОчищенные ферменты, либо рекомбинантные или синтетические, давая ценную информацию о "в пробирке" ингибирования NC тестируемыми соединениями. Это "сила и слабость" анализа: имя может также дополнить виртуального скрининга и молекулярного моделирования подходы в предварительных шагов программы обнаружения наркотиков, что позволяет быстро создавать и анализировать отношения структура-активность и в конечном итоге перенаправления синтеза и наркотиков дизайн. Однако, как и другие биохимические анализы используются в проектах по разработке лекарственных средств в области ВИЧ, NAME не даст информацию о последствиях предполагаемых ингибиторов в инфицированных вирусом клеток.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by Ministero degli Affari Esteri (MAE, DRPG, Unità per la cooperazione scientifica e tecnologica, Grant: PGR Italy-USA) and by MIUR, Progetti di Ricerca di Interesse Nazionale (Grant: 2010W2KM5L_006).
Name of Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
cTAR, 29-mer DNA oligo. Desalted. HPLC purified. | Metabion International AG | Store the stock solution at -20 °C | |
TAR, 29-mer RNA oligo. Desalted. HPLC purified. | Metabion International AG | Store the stock aliquot at -80 °C | |
(12-55)NC peptide | EspiKem srl | Store the stock solution at -20 °C | |
1.5 mL tubes | Eppendorf | 0030 120 086 | Autoclave before use |
0.5 mL tubes | Eppendorf | 0030 121 023 | Autoclave before use |
Biosphere Filter Tips 0.1-10 µL | Sarstedt | 701,130,210 | |
Biosphere Filter Tips 2-20 µL | Sarstedt | 70,760,213 | |
Biosphere Filter Tips 200 µL | Sarstedt | 70,760,213 | |
Syringe Filter 0,22 µm | Biosigma srl | 51,798 | |
Ethanol | Carlo Erba | 414631 | |
Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma-Aldrich | 71725-50G | |
Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418-1L | |
Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | 71376-1KG | |
Boric Acid | Sigma-Aldrich | B0252-2.5KG | |
Ethylenediaminetetraacetic Acid | Sigma-Aldrich | E5134-500G | |
Magnesium Perchlorate | Sigma-Aldrich | 222283-100G | Store the 1M solution at -20°C |
Glycerol | Sigma-Aldrich | 49770-1L | |
Bromophenol Blue | GE Healthcare Life Sciences | 17-1329-01 | |
N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine | Sigma-Aldrich | T9281-100ML | |
Ammonium Persulfate | Sigma-Aldrich | A7460-500G | Prepare the 10% solution freshly before use |
Acrylamide-bis ready-to-use solution 40% (19:1) | Merck Millipore | 1006401000 | Polyacrylamide is highly neurotoxic: wear gloves during the gel casting |
Tris ultrapure | Applichem | A1086,1000 | |
DEPC-treated water | Ambion | AM9922 | |
Centrifuge 5415R | Eppendorf | 22,621,408 | |
NanoDrop 1000 spectrometer | Thermo Scientific | ||
UV-VIS spectrometer Lambda 20 | Perkin Elmer | ||
Protean II xi Cell | Bio-Rad | 165-1803 | |
PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad | 164-5050 | |
SybrGreen II RNA Gel Staining | Lonza | 50523 | Make the 1/10000 dilution in TBE 1X. Store it in the dark at 4°C for two weeks |
Geliance 600 Imaging System | Perkin Elmer |