Ontwikkeling van inhibitoren van eiwit-eiwit interacties door middel van VERVANGEN: Toepassing op het ontwerp en de ontwikkeling van niet-concurrerende ATP CDK-remmers
Summary
We describe implementation of the REPLACE strategy for targeting protein-protein interactions. REPLACE is an iterative strategy involving synthetic and computational approaches for the conversion of optimized peptidic inhibitors into drug like molecules.
Abstract
REPLACE is een unieke strategie ontwikkeld om gerichter eiwit-eiwitinteracties (PPI). Het doel is om beschikbare drug doel ruimte uit te breiden door middel van een verbeterde methode voor het identificeren van remmers voor dergelijke bindingsplaatsen en die vormen de meerderheid van de potentiële drug targets. Het belangrijkste doel van deze paper is om een methodologisch overzicht van het gebruik en de toepassing van de VERVANGEN strategie die computational en synthetische chemie benaderingen gaat bieden. REPLACE wordt geïllustreerd door middel van de toepassing ervan op de ontwikkeling van niet-competitieve ATP cycline afhankelijke kinasen (CDK) inhibitoren als anti-tumor therapieën. CDK's worden vaak gedereguleerd bij kanker en dus worden beschouwd als belangrijke doelen voor de ontwikkeling van geneesmiddelen. Remming van CDK2 / cycline A in S-fase is gerapporteerd selectieve apoptose van kankercellen in een p53-onafhankelijke wijze te verminderen door de E2F1 route. Gericht op de interactie eiwit-eiwit op het cycline binding groef (CBG) is een benadering die de specifieke remming van de celcyclus dan transcriptie CDKs zal toestaan. Het CBG wordt herkend door een consensus sequentie afgeleid van CDK substraten en tumor suppressor eiwitten aangeduid als de cycline bindingsmotief (CBM). De CBM eerder is geoptimaliseerd om een octapeptide uit p21WAF (HAKRRIF) en dan verder ingekort tot een pentapeptide behoud van voldoende activiteit (RRLIF). Peptiden in het algemeen niet celpermeabel, metabolisch onstabiel en derhalve de REPLACE (gedeeltelijke vervanging Ligand Alternatieven tot Computational Enrichment) strategie om meer geneesmiddelachtige inhibitors genereren toegepast. De strategie begint met het ontwerp van het Fragment afgebonden remmende peptiden (salto) die selectief celcyclus CDK / cycline complexen remmen. Flips werden gegenereerd door het vervangen van residuen van iteratieve HAKRRLIF / RRLIF met fragment zoals kleine moleculen (kapgroepen) vanaf de N-terminus (Ncaps), gevolgd door vervanging vande C-terminus. Deze verbindingen zijn uitgangspunten voor het genereren van niet-competitieve ATP CDK inhibitoren als anti-tumor therapieën.
Introduction
In dit artikel wordt een case study van de toepassing van de REPLACE (vervangen met gedeeltelijke ligand alternatieven met behulp van computationele verrijking) strategie om peptidische remmers van eiwit-eiwit interacties te zetten in meer farmaceutisch relevante moleculen beschreven 1-3. Terwijl PPI's vertegenwoordigen een rijke maar onderbenut bron van potentiële drug targets, bestaande methoden zijn grotendeels onvoldoende om deze op grote schaal toegankelijk te maken. De huidige strategieën waaronder fragment based design 4, high-throughput screening 5 en geniete peptiden 6 verstrekte voorschotten, maar deze zijn in veel gevallen niet effectief. Hierdoor meer vooruitgang en efficiëntere benadering vereist. REPLACE is volledig gevalideerd in de ontwikkeling van kinaseremmers die drug-achtige eigenschappen zijn verbeterd en hebben potentieel voor verdere ontwikkeling als anti-tumor therapieën. Deze strategie is geïllustreerd in de ontwikkeling van niet-ATP remmers celcycle CDKs en gaat als volgt: 1) het verkrijgen van 3D structurele gegevens over de interactie van HAKRRLIF / RRLIF het cycline bindende groef; 2) het bepalen van de belangrijke determinanten voor binding peptide interactie; 3) afknotting van het peptide N-terminus bevattende een of meer bindende determinanten; 4) computationele identificatie van potentiële kleine molecule alternatieven (gedeeltelijke ligand alternatieven, PLA) voor het afgeknotte deel van het peptide en die te behouden belangrijke interacties van de ouder peptide; 5) synthese of commerciële inkoop van Plas voorspeld te gretig te binden met de subsite eerder door de verwijderde peptide residu (s) bezet; 6) synthese van flips door middel van ligatie van de beste PLA om het afgeknotte peptide met vastefasesynthese; 7) het testen van klapt in een in vitro binding of functionele test (fluorescentie polarisatie in de CDK / cycline context) gevolgd door verdere karakterisering in cellevensvatbaarheid assay. Een schematische weergave van VERVANGEN strategy is weergegeven in figuur 1. In dit artikel worden iteraties van REPLACE strategie besproken en de toepassing CDK2 / cycline A beschreven. CDK's zouden direct of indirect gedereguleerd in de meeste tumoren en worden derhalve geacht passend kanker drug targets 7. CDKs vereisen samenwerking met cyclinen voor volledige activering en vervolgens fosforyleren belangrijkste eiwitten die betrokken zijn bij de celcyclus regulatie 8. De twee grote groepen van CDKs zijn de isotypen dat celcyclus controleposten controle [G1 / S (CDK4 / Cycline D, CDK6 / cycline D en CDK4 / cycline E), S-fase (CDK2 / cycline A) en G2 / M (CDK1 / cycline B)] en de toezichthouders van de RNA-polymerase door middel van fosforylering (cdk7 / cycline H, CDK8 / cycline C, CDK9 / cycline T). Een belangrijke stap in de S-fase progressie optreedt wanneer de transcriptiefactor E2F1 gecomplexeerd het DP-eiwit dat vervolgens bindt aan DNA en initieert gentranscriptie. CDK2 / cycline A is vereist om transcriptie te neutraliseren E2F1activiteit door middel van fosforylering hetgeen leidt tot loslaten van de E2F1-DP complex en de daaropvolgende degradatie. Remming van CDK2 / cycline A wordt aangenomen dat E2F1 in zijn DNA gebonden toestand leidt tot aanhoudende activatie handhaven. De resulterende mate van E2F-1 activiteit de drempel moeten p53 onafhankelijke apoptose induceert dus duidt op een therapeutische strategie overtreffen. Door gedereguleerd p53 en pRb pathways, hoge niveaus van E2F-1 regelmatig optreden in kankercellen en remming van CDK2 / cycline A moet leiden tot selectieve apoptose in tumoren en kan worden beschouwd als een gevalideerde kanker doelwit 7.
Onderzocht CDK remmers klinisch richten de sterk geconserveerde ATP-bindingsplaats leidt tot de reactiviteit steken van de meer dan 500 eiwitkinasen in de menselijke kinome en mogelijk aanleiding geven tot effecten en toxiciteit 9 zijkant. Een alternatieve benadering is niet ATP-competitieve remming door zich te richten werving substraat door het CBGaanwezig op positieve regulerende cycline subunit en dat derhalve gescheiden en op afstand van ATP bindingsplaats 10,11. Het CBG is vooral een hydrofoob groef aanwezig cycline A, cycline D en cycline E en blijkt een consensussequentie in substraten en tumor suppressors herkennen. Aangezien een geïsoleerd peptide, het cycline bindende motief (CBM) bindt aan het CBG en is aangetoond dat kinaseactiviteit van de celcyclus CDK's remmen. De CBM is geoptimaliseerd om een octapeptide (HAKRRLIF, CDK2 / cycline A IC50 0,07 ± 0,02 uM, CDK4 / cycline D, IC 50 0,88 ± 0,34 uM) en voorts afgeknotte een pentapeptide die een goed compromis tussen moleculaire gewicht voor drugs- gelijkenis en potentie (RRLIF, CDK2 / cycline A IC 50 1,01 ± 0,17 uM, CDK4 / cycline D, IC 50 25.12 ± 2.97 uM) 12,13. Het CBGS bestaat uit een grote primaire en secundaire kleinere hydrofobe pocket die worden overbrugd door een acidic regio (inclusief Glu220, Glu224 en Asp283). De belangrijkste bindingsdeterminanten van HAKRRLIF omvatten de interactie van Ala2 met additionele hydrofobe pocket, ionenparing en waterstofbindingen van Lys3, Arg 4 en Arg5 het zure gebied en een hoge mate van complementariteit van Leu6 en pHE8 de primaire lipofiele plaats. Bovendien worden talrijke waterstofbruggen bijdrage van het peptide hoofdketen terwijl Ile7 fungeert als afstandhouder residu zodat optimaal contact met de primaire zak. De bindingsmodus en interacties van HAKRRLIF met CBG is getoond in figuur 2.
Gericht op de CBM / CBG eiwit-eiwit interacties zullen kinaseactiviteit van CDK2 / cycline A, CDK2 / cycline E & CDK4 / cycline D te remmen en dit moet leiden E2F1 gemedieerde apoptose van kankercellen zonder dat afgeweken normale cellen 7. Hoewel CBM afgeleide peptiden zijn effectieve remmers van celcyclus-CDK's, is het onwaarschijnlijk dat zij nuttig als geneesmiddelen zullen zijn vanwege hun metabolischeinstabiliteit en algemene gebrek aan celdoorlaatbaarheid. Daartoe hebben we de REPLACE strategie om deze potente peptidische remmers te zetten in meer drug-achtige verbindingen voor de verdere ontwikkeling van anti-tumor therapieën benutten gedereguleerd E2F1 tot CDK2 / cycline A inhibitie toegepast. Het volgende protocol vat werk dat bij de toepassing van REPLACE de cycline groove voltooid. In eerste instantie werden drug-like capping groep vervanging van het N-terminale tetrapeptide van HAKRRLIF geïdentificeerd. Bovendien werden verbeteringen in deze groepen onderzocht in een extra validatie studie voor te vervangen. Representatieve resultaten van deze studies worden gepresenteerd.
Protocol
Representative Results
Discussion
Targeting protein-protein interactions (PPI) in drug discovery is highly challenging as these typically involve a large shallow contact interface comprised of numerous and diffuse contacts19. Furthermore, peptidic compounds which inhibit PPI’s that are amenable to drug discovery are problematic due to their higher molecular mass, metabolic instability and poor bioavailability20. Current strategies that have been applied for the development of PPI inhibitors include design of proteomimetics and…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr’s. Douglas Pittman and Michael Wyatt for their assistance with cell culture and Dr Wyatt and Ms. Erin Anderson for help in development of the binding assays. We acknowledge Mike Walla and Bill Cotham in the Department of Chemistry and Biochemistry at the University of South Carolina for assistance with Mass Spectrometry, Helga Cohen and Dr. Perry Pellechia for NMR spectrometry. This work was funded by the National Institutes of Health through the research project grant, 5R01CA131368.
Materials
| Computational Chemistry | |||
| Accelyrs Discovery studio 3.0 | |||
| Dell Optiplex Workstations | |||
| Synthetic Organic Chemistry | |||
| Silica gel (GF-254 plates) for TLC, Biotage (Uppsala, Sweden) for flash chromatography, Waters Alliance 2695 HPLC with a 2996 diode-array detector and equipped with a C18 (2) 100 A, 250 x 4.6mm, 5μm column (Phenomenox Luna) for purity determination, 1H NMR and 13C NMR spectra were recorded with a Varian Mercury 300 and 400 Spectrometer, respectively. Mass spectra were measured with a Micromass QTOF (Tandem quadruple-1 time of flight mass spectrometer), electrospray ionization (ESI) and VG 70S (Double-focusing magnetic sector mass spectrometer, EI). | |||
| Flourescence Polarization Assay | |||
| 384 micro well plates, , Micro pipets, | Grenier Bio-one | 110256602 | |
| CDK4D1 and CDK2CA (well purified recombinant human kinase complex) | BPS Bio Sciences | 40094(CDK4/Cyclin D), 41101(CDK2/Cyclin A) | |
| assay buffer (25 nM HEPES pH 7, 10 mM NaCl, 0.01% Nonidet P-40, 1mM dithiothretiol (DTT), | |||
| 25 nM HEPES | CALBIOCHEM | 375368 | |
| NaCl | Fisher | 127838 | |
| Nonidet P-40 | US Biological | N3500 | |
| DTT | Aldrich | ||
| -70c freezer | Revco (Ultima II) | ||
| DTX880 multimode detector fitted with 485 nm/535 nm excitation/emission filters and a dichroic mirror suitable for fluorescein | Beckman Coulter, Brea, CA | ||
| Cell Culture | |||
| 96 well plates, | Fisher | ||
| Frozen stocks of U2OS (osteosarcoma) and DU145 (prostate cancer) cell lines | ATCC | ||
| NU serum, DMEM media, trypsin, PEN/STRIP, MTT reagent, | Fisher, Life technology, Alfa Aesar | ||
| Heamocytometer | VWR | ||
| -70c freezer | Revco (Ultima II) | ||
| Incubator | Thermo electron corporation | ||
| Centrifuge | Eppendorf | 5804 R | |
| Refrigerator 4-8C | Isotemp Fisher | ||
| DTX880 multimode detector fitted with 595nm filter. | Beckman Coulter, Brea, CA | ||
References
- Andrews, M. J., et al. REPLACE: a strategy for iterative design of cyclin-binding groove inhibitors. Chembiochem. 7, 1909-1915 (2006).
- Liu, S., et al. Optimization of Non-ATP Competitive CDK/Cyclin Groove Inhibitors through REPLACE-Mediated Fragment Assembly. J Med Chem. 56, 1573-1582 (2013).
- McInnes, C., Bernstein, M., Desai, P. Chapter 29. Annual Reports in Medicinal Chemistry. 47, 459-474 (2012).
- Bower, J. F., Pannifer, A. Using fragment-based technologies to target protein-protein interactions. Curr Pharm Des. 18, 4685-4696 (2012).
- Makley, L. N., Gestwicki, J. E. Expanding the number of ‘druggable’ targets: non-enzymes and protein-protein interactions. Chemical biology, and drug design. 81, 22-32 (2013).
- Walensky, L. D., Bird, G. H. Hydrocarbon-Stapled Peptides: Principles, Practice, and Progress. J Med Chem. , (2014).
- Shapiro, G. I. Cyclin-dependent kinase pathways as targets for cancer treatment. J Clin Oncol. 24, 1770-1783 (2006).
- Thais, M., Sielecki, J. F. B., Enfield, P. A., Trainor, G. l. Cyclin dependant kinase inhibitors: Useful targets in cell cycle regulation. Journal of medicinal chemistry. 43, 1-18 (2000).
- Morphy, R. Selectively nonselective kinase inhibition: striking the right balance. J Med Chem. 53, 1413-1437 (2010).
- Chen, Y. N., et al. Selective killing of transformed cells by cyclin/cyclin-dependent kinase 2 antagonists. Proc Natl Acad Sci USA. 96, 4325-4329 (1999).
- Orzaez, M., Gortat, A., Mondragon, L., Bachs, O., Perez-Paya, E. ATP-noncompetitive inhibitors of CDK-cyclin complexes. ChemMedChem. 4, 19-24 (2009).
- Kontopidis, G., et al. Insights into cyclin groove recognition: complex crystal structures and inhibitor design through ligand exchange. Structure. 11, 1537-1546 (2003).
- McInnes, C., Andrews, M. J., Zheleva, D. I., Lane, D. P., Fischer, P. M. Peptidomimetic design of CDK inhibitors targeting the recruitment site of the cyclin subunit. Current medicinal chemistry. Anti-cancer agents. 3, 57-69 (2003).
- Premnath, P. N., et al. Fragment based discovery of arginine isosteres through REPLACE: towards non-ATP competitive CDK inhibitors. Bioorganic, and medicinal. 22, 616-622 (2014).
- Venkatachalam, C. M., Jiang, X., Oldfield, T., Waldman, M. LigandFit: a novel method for the shape-directed rapid docking of ligands to protein active sites. J Mol Graph Model. 21, 289-307 (2003).
- Mendoza, N., et al. Selective cyclin-dependent kinase 2/cyclin A antagonists that differ from ATP site inhibitors block tumor growth. Cancer Res. 63, 1020-1024 (2003).
- Denizot, F., Lang, R. Rapid colorimetric assay for cell growth and survival. Modifications to the tetrazolium dye procedure giving improved sensitivity and reliability. J Immunol Methods. 89, 271-277 (1986).
- Zheleva, D. I., et al. Highly potent p21(WAF1)-derived peptide inhibitors of CDK-mediated pRb phosphorylation: delineation and structural insight into their interactions with cyclin A. The journal of peptide research : official journal of the American Peptide Society. 60, 257-270 (2002).
- Ivanov, A. A., Khuri, K. F. R., Fu, H. Targeting protein-protein interactions as an anticancer strategy. Trends in Pharmacological Sciences. 34, (2013).
- Thayer, A. M. Improving peptides. Chemical and Engineering News. 89, 13-20 (2011).
- Yin, H., Hamilton, A. D. Strategies for targeting protein-protein interactions with synthetic agents. Angew Chem Int Ed Engl. 44, 4130-4163 (2005).
- Jubb, H., Higueruelo, A. P., Winter, A., Blundell, T. L. Structural biology and drug discovery for protein-protein interactions. Trends Pharmacol Sci. 33, 241-248 (2012).
- Cannon, J. B. Pharmaceutics and drug delivery aspects of heme and porphyrin therapy. J Pharm Sci. 82, 435-446 (1993).
