Here we present a procedure to measure total culturable viruses using the Buffalo Green Monkey kidney cell line. The procedure provides a standardized tool for measuring the occurrence of infectious viruses in environmental and drinking waters.
A standardized method is required when national studies on virus occurrence in environmental and drinking waters utilize multiple analytical laboratories. The U.S Environmental Protection Agency’s (USEPA) Method 1615 was developed with the goal of providing such a standard for measuring Enterovirus and Norovirus in these waters. Virus is concentrated from water using an electropositive filter, eluted from the filter surface with beef extract, and then concentrated further using organic flocculation. Herein we present the protocol from Method 1615 for filter elution, secondary concentration, and measurement of total culturable viruses. A portion of the concentrated eluate from each sample is inoculated onto ten replicate flasks of Buffalo Green Monkey kidney cells. The number of flasks demonstrating cytopathic effects is used to quantify the most probable number (MPN) of infectious units per liter. The method uses a number of quality controls to increase data quality and to reduce interlaboratory and intralaboratory variation. Laboratories must meet defined performance standards. Method 1615 was evaluated by examining virus recovery from reagent-grade and ground waters seeded with Sabin poliovirus type 3. Mean poliovirus recoveries with the total culturable assay were 111% in reagent grade water and 58% in groundwaters.
肠道病毒是可感染人体肠道系统并且经由粪 – 口途径被发送的病毒不同群体。这些病毒通过污水处理厂和化粪池污水,设计不当或破损化粪池,下水道坏了线条,结合下水道溢出,等点和非点源1-4进入地表水和地下水。从水性病毒人类感染和疾病经由受污染的或未经消毒的水耗,或通过休闲水接触发生。疾病症状可能涉及轻微到严重胃肠炎;结膜炎;发热;上呼吸道窘迫;手足口病;心肌炎;无菌性脑膜炎;脑炎;麻痹; 5-8败血症,甚至死亡9,10。
USEPA方法1615提供了一个方法来衡量环境和水饮用肠道传染病毒颗粒。这些水域可含有感染性和非感染性病毒体的混合物,但只有感染性颗粒构成潜在的健康危害。感染性病毒颗粒由于可能存在的11-13任何消毒剂丧失感染性超过在从蛋白质衣壳的完整性,核酸由于来自太阳光的紫外线辐射,以及损坏损坏损失环境和饮用水的时间。在该方法中提供的总可培养病毒程序是基于生产的布法罗绿猴肾(BGM)细胞系细胞病变效应(CPE)。该细胞系的选择是因为它在环境病毒学领域14,15的广泛使用,即使检测到的感染性病毒类型的范围主要限于某些肠道病毒15。本文的目的是描述为五英寸的阳电筒式过滤洗脱,仲浓度和总可培养病毒测量方法1615的程序。的评估整个方法中Cashdollar 等人 16进行说明。
USEPA方法1615是为无管制的污染物监测法规的第三监视周期(UCMR3)17中使用而开发的,并主要用于测量地下水发生病毒设计。这股数与信息收集规则(ICR)方法,15,18常见的步骤,但有两个细微的差别。两者都使用量子实验来测量被基于最大可能数(MPN)的计算产生CPE的BGM细胞单层与定量病毒。方法1615允许从各种水基体集中的病毒采用了较新的正电过滤器,并减少细胞培养试验容器的数量每稀释重复20至10这两个微小的变化降低整体成本的方法。在重复的数量的减少降低了劳动,但导致略微较低的检测极限。虽然地下水预期具有较低浓度的病毒比表层水,19,20第测定样品电子量是五倍地表水,在用于不同部分补偿。使用更少的重复的将是足以满足大多数地表水,但有些需要稀释样品。
方法1615有几个关键的步骤和限制。牛肉提取物有所不同批次。每批应进行病毒洗脱效率和通过二级浓缩步骤的能力,病毒浓度测试所描述的是补充材料部分S2.3。该方法使用精确的公式,用于计算样品的量接种到BGM的细胞培养物,并确定病毒滴度。如果这些式不严格遵循不准确的结果将生成。必须用于维持细胞培养物适当无菌技术。该显示在14天的潜伏期窘迫未感染的BGM细胞培养控件可能表明与细胞培养维护问题。大保养也必须TA肯中吹打涉及的接种和培养基除了细胞培养瓶中,以避免交叉污染的步骤。在补充材料S2节中描述的质量控制必须严格的执行。第S2还提供故障排除建议的质量问题。
病毒吸附的主要机制,以正电的过滤器是与过滤器上的正电荷的强度和病毒的有关它的等电点负电荷的强度和被测试21的水的pH值的电荷相互作用。从过滤洗脱也由这些相互作用的强度的影响。因为它们之间病毒类型和甚至在相同类型的内菌株而变化,从过滤器的洗脱不统一。这意味着,任何结果可能低估病毒存在于环境水的实际水平。使用单一的BGM细胞系也低估了病毒的发生。范围的,可以在该细胞系主要被限制为脊髓灰质炎病毒和肠病毒乙物种的血清型,以及一些呼肠孤病毒14,15,22产生的CPE肠溶病毒。其他传染性病毒类型将不被检测到。
从地面和试剂级水脊髓灰质炎病毒回收率满足USEPA方法1615性能验收标准为性能评价(PE; 也就是 ,接种试剂级水样与用于评估分析之前的起动性能滴度未知分析师一项研究)和LFB样品(补充材料表S1)的。从使用培养过程地下水58%的回收率是类似于由其他人使用自来水23,24的报道。从111%的LFB样本变异的100%(CV)的系数,平均回收率也达到了性能的方法验收标准,即使他们比,对于PE样品观察到更高DURING的ICR。 ICR意味着实验室间回收率为56%与92%的变化(CV)的一个系数而平均实验室内回收率从36变化到85%(的CV 58至131%;从所述ICR体育数据库未公布的数据)。在这项研究中用于低种子LFB样品比更高的种子样品(122对比42%)观察到更高的回收率。在该ICR正在计划的时候,有人预计,接受较低的种子值PE样品将具有更低的复苏,那些接受高种子。类似于这里观察到LFB样品,ICR PE样品脊髓灰质炎病毒回收率为71%(CV 100%),54%(CV 69%),和44%(CV 71%)为种子值≤300MPN,300- 1500 MPN和> 1500 MPN,分别为。
有水样25测量传染性病毒许多方法。这种方法是在相对于在标准化程度的其它方法显著。标准化不仅包括质量和性能的控制,而且还使用定义的卷和公式,以确保所有的分析实验室进行相同的方法。没有标准化,所以很难在整个实验室比较的结果,并且因此导通在多个分析实验室规模的研究,当标准化是必不可少的。与内置在标准化此方法可以在将来进行扩展以包括额外的病毒类型和细胞系。研究正在进行中,以纳入腺病毒的进入方法提供数据。
The authors have nothing to disclose.
The authors thank Dr. Mark Borchardt, U.S. Department of Agriculture, Marshfield, WI, for supplying the Sabin poliovirus serotype 3 used in this study; Mary Jean See, Nancy Schable, and Jenifer Jones of Dynamac Corporation for preparation of BGM cultures; Nichole E. Brinkman, Shannon M. Griffin, Brian R. McMinn, Eric R. Rhodes, Eunice A. Varughese, Ann C. Grimm, Sandhya U. Parshionikar, and Larry Wymer for contributions in the overall evaluation of USEPA Method 1615; Gretchen Sullivan for technical assistance; and local private well owners and utilities for allowing us to collect water samples. Although this work was reviewed by USEPA and approved for publication, it may not necessarily reflect official Agency policy. Mention of trade names or commercial products does not constitute endorsement or recommendation for use.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Beef extract, desiccated powder | BD Bacto | 211520 | |
Cryogenic tubes | Thermo Fisher | 3775/945373 | |
Hank’s balanced salt solution | Invitrogen | 14170-112 | |
Mechanical rocking platform | Daigger | EF4907G | |
Orbital shaker | Thermo Fisher | 14-285-729 | |
Sterilizing filter with prefilter | VWR | 28143-295 | |
Sterilizing syringe filter | Corning | 431219 | |
pH Standards | Sigma-Aldrich | 33643, 33646, 33648 | |
MEM | Sigma-Aldrich | M1018 or M4642 | |
Leibovitz L-15 | Sigma-Aldrich | L4386 | |
Sodium bicarbonate, 7.5% | Sigma-Aldrich | S8761 | |
Fetal bovine serum | Invitrogen | 10082-139 | |
Antibiotic-Antimycotic | Life Technologies | 15240-062 | |
Trypsin, EDTA | Invitrogen | 25200072 |