Summary

Makrofaj Kolesterol tükenmesi ve Fagositoz Üzerine Etkisi<em> Cryptococcus neoformans</em

Published: December 19, 2014
doi:

Summary

In this article, a protocol for infection of macrophages with Cryptococcus neoformans is described. Also, a method for sterol depletion from the macrophages is explained. These protocols provide a guide to study fungal infections in vitro and examine the role of sterols in such infections.

Abstract

Kriptokokkozis cinsi, Cryptococcus patojenik mantarların neden olduğu bir yaşamı tehdit edici hastalıktır. Enfeksiyon akciğerin derinlerine içinde replike olan sporların, teneffüs sırasında görülür. Makrofajlar tarafından Cryptococcus fagositozu hastalığı, ölümcül meningoensefalit neden merkezi sinir sistemi içine yayabilen yollarından biridir. Bu nedenle, Cryptococcus ve makrofajlar arasındaki ilişkinin incelenmesi enfeksiyonun ilerlemesinin anlamak önemlidir. Bu çalışmada C. makrofaj enfektivitesini incelemek için bir adım-adım protokolü açıklanır in vitro neoformans. Bu protokolü kullanarak, konak-patojen etkileşimleri ev sahibi steroller rolü incelenmiştir. Metil farklı konsantrasyonları – siklodekstrin (MCD), sıçangil sarkomu retikulum makrofaj benzeri hücre hattı J774A.1 kolesterol tüketmek için kullanılmıştır. Kolesterol tükenmesi doğrulandı ve ticari availabl kullanarak hem kantifıyeE kolesterol ölçümü kiti ve ince tabaka kromatografisi. Kolesterol tükenmiş hücreleri lipopolisakkarittir (LPS) ve interferon gamma (IFNy) ile aktive edilir ve 1 arasında bir efektör-hedef oranında antikor opsonize Cryptococcus neoformans, vahşi tip H99 hücreleri ile enfekte edilmiştir: 1 arasındadır. Enfekte hücreler, C ile inkübasyon 2 saat sonra izlenmiştir neoformans ve fagositik indeksi hesaplandı. Kolesterol tükenmesi fagositik indeksinde önemli bir azalma ile sonuçlandı. sunulan protokoller laboratuar ortamında enfeksiyon sürecinin başlatılmasını taklit ve enfekte ev sahibi lipit kompozisyonu rolünü incelemek için uygun bir yöntem sunuyoruz.

Introduction

Fagositoz hücre dışı kişiler konakçı hücreler tarafından olan bir süreçtir. Bu patojenlere karşı savunmak için bağışıklık sisteminin cephanelik önemli bir silahtır, ama süreç genellikle içselleştirme ve vücutta 1 yayılan sağlamak için patojenler tarafından yıkılabilir olabilir. Fagositoz konukçu hücrenin hücre iskeletinin yeniden düzenlemeler yoluyla bağlanması ve yutulma neden olan bazı sinyal olayları aracılık eder. "Profesyonel" fagositler bağlanması ve patojen yutmak ve phagosome 2 oluşturan lamellipodia oluşması için sinyal istilacı patojenin yüzeyinde opsonins ayırt eden ve bağlanan edebiliyoruz. Sözde 'profesyonel' fagositler arasında makrofajlar. Makrofajlar çoğu, arayan ve hastalığa neden olan ajanlar ortadan kaldırarak, hasarlı dokuların onarımı ve inflamasyon aracılık dahil koruyucu fonksiyonlarını yürütmek son derece uzmanlaşmış hücrelerdirfagositoz 1,2 sürecinde bu.

Cryptococcus neoformans cryptococcosis olarak bilinen ciddi bir hastalığa neden patojenik maya türüdür. Cryptococcus sporlar ev sahibi tarafından inhale ve genellikle asemptomatik bir akciğer enfeksiyonu neden vardır. Bu poz son derece yaygın olduğu düşünülmektedir; Ankete tüm bu kriptokok polisakkarit glucuronoxylomannan ve diğer çalışmalara antikor olduğunu Kliniği Bronx-Lübnan Hastanesi Merkezi'nde bulunan Çocuk Enfeksiyon Hastalıkları 61 çocuklu bir örnek, hem insan immün yetmezlik virüsü (HIV) enfekte olmayan ve enfekte yetişkinlerin 3 prevalansı göstermiştir 4. Alveoler makrofajlar başarıyla net patojen akciğer enfeksiyonuna ve çoğu durumda yanıtın ilk satırı vardır. Ancak, bağışıklığı baskılanmış kişilerde (örneğin, HIV ve AIDS hastaları) maya makrofajlar içinde hayatta yapabiliyor. Bunlardadavalar, makrofajlar patojenin çoğalması için bir niş olarak hizmet verebilir ve hastalık ölümcül hale 5 santral sinir sistemi (MSS) onun yayılmasını kolaylaştırabilir – 8. 11 – Bu makrofajlar hatta "Truva atı" modeli 3,9 yoluyla kan beyin bariyerini geçmeye maya yardımcı meninkslerde doğrudan maya teslim düşünülmektedir. Böylece, bu fagositoz sürecini ve özellikle kriptokoksik enfeksiyonlarda, bunu etkileyen faktörleri anlamak önemlidir.

15 – Diğer patojen sistemlerinde Önceki çalışma fagositozu 12 oynamak için önemli bir role sahip olduğu kolesterol oluşturduğu kolesterol ve lipid sallar işaret. Kolesterol, memeli hücrelerde en fazla lipit türdür ve 25 ihtiva eder – memeli hücre zarı 16, 50%. Bu BIOP modüle bir rol oynadığı tespit edilmiştirrijiditelerini 17 değiştirerek zarların hysical özellikleri. Kolesterol ve sfingolipitler birlikte lipid sallarının olarak bilinen membran lipit mikro bölgelerini oluştururlar. 18 – lipid sallarının kaveolanın oluşumu, hem de 16 sinyal belirli tipleri için, izole edilmiş bir etki sağlayan ilgili olduğu tespit edilmiştir. Nedeniyle, küçük boyutları nedeniyle, in vivo olarak, lipid sallar çalışmak zordur. Lipid sallar rolünü incelemek için yararlı bir yolu, onların bileşenleri değiştirmek için. Metil-β-siklodekstrin (MβCD) memeli zarlarda kolesterol tüketen bulunmuştur ve yaygın olarak lipid sallarının 18 rolünü araştırmak için kullanılan bir bileşimdir.

Bu protokol, konakçı hücre zarlarından kolesterol tüketen ve C fagosite konakçı hücrelerin yeteneği üzerindeki tükenmesi etkisinin belirlenmesi için bir yöntem sunmak in vitro neoformans. Bu prosedür, hücre kültürü techniq kullanırenfeksiyonu için bir model olarak hücre hattı (J774A.1) gibi ölümsüzleştirilmiş makrofaj üzerinde daah. Kolesterol tükenmesi sterol büyüklüğüne özel bir hidrofobik bir çekirdeğe sahiptir ve kolesterol zar 19 dışarı çekmek için bir havza olarak etki edebilir MβCD, maruz bırakılarak gerçekleştirilmiştir. Kolesterol tükenmesi kantitatif olarak ticari olarak temin edilebilen bir kit kullanılarak ve niteliksel olarak ince tabaka kromatografisi (TLC), daha sonra da 20 modifiye edilmiş bir Bligh-Dyer lipid ekstraksiyonu kullanılarak ölçülmüştür. . 23 – fagositoz makrofajları aktive edilmesi için, interferon-γ ve lipopolisakkarit bir kokteyl ile karıştırılır opsonize bir maya kültürünün hücre hattı enfekte ölçülmüştür Cryptococcus bir glucuronoxylomannan (GXM) antikor ya 21 ile opsonize edilmiştir. Boyama ve mikroskopi deneyleri fagositoz derecesini değerlendirmek için hücrelerin görselleştirme ve fagositik endeksinin hesaplanmasında izin verdi. Bu protokol d birlikte ele alındığındafizyolojik bir süreç ile, lipid bileşimin değiştirilmesini entegre temel bir metodu escribes.

Protocol

MβCD ile J774A.1 Hücreleri 1. Kolesterol tükenmesi Steril bir biyo-güvenlik kabini, tohum 10 5 J774A.1 makrofaj-benzeri hücreler, göz başına,% 10 fetal sığır serumu (FBS) ile takviye edilmiş Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) içinde 200 ul% 1, 96-iyi hücre kültür plakası üzerine penisilin / streptomisin (P / S). 37 ° C'de inkübe edilir ve% 5 CO2 O / N. Hücre mono tabakasının ortamı çıkarın ve süzüldü otoklave edilmiş 1 x fosfat tamponlu tuz…

Representative Results

Kolesterol tükenmesi 1x PBS kontrol ile karşılaştırıldığında Amplex Red Kolesterol Test kitinde, üretici talimatlarına göre protokol aşama 1.3 ayrılmış yüzer analizi MβCD ile muamele edilen numune kolesterolün yüksek bir konsantrasyonu elde edilir. Hücre tipine ve MβCD konsantrasyonu, kullanılan kolesterol azaltımı bağlı olarak değişebilir. 10 mM MβCD ile muamele J774 için, yaklaşık% 50 oranında bir azalması görülmektedir. Boşaltma 1.4 adım (Şekil…

Discussion

Bu protokol ile çalışırken bu C memeli hücreleri kaplama ve opsonizasyon zaman doğru hücre sayılarını elde etmek önemlidir neoformans hücreleri. Bu çalışmalar arasındaki varyasyon en aza indirir ve doğru 1 sağlar: çalışma boyunca efektör oranı 1 hedef. Ayrıca prosedürler arasında oda sıcaklığında istirahat opsonize maya hücreleri ya da muamele edilmiş makrofaj hücreleri önlemek için kolesterol azaltımı ve enfeksiyon zamanlamasını koordine edecek tarzda önemlidir….

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma NIH hibe MDP için AI56168, AI71142, AI87541 ve AI100631 tarafından desteklenmiştir. Maurizio Del Poeta Enfeksiyon Hastalıkları Burroughs Wellcome Araştırmacı olduğunu.

Materials

Name of Reagent/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
Class II type A2 Biosafety Cabinet Labconco 3460009
J774A.1 cell line ATCC TIB-67 Arrives Frozen. See ATCC instructions for culturing.
Dulbecco’s Modified Eagle Medium Gibco 11995-065 Store at 4 °C and warm to 37 °C prior to use
HI Fetal Bovine Serum Performance Plus Gibco 10082-147 Keep frozen at -20 °C and thaw before adding to DMEM
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Gibco 15140-122 Used to suplement DMEM
Isotemp Cell culture incubator Fisher Scientific Model # 3530
96-Well culture dish Corning Inc. Costar 3595
10x Phosphate Buffered Saline Fisher Scientific BioReagents BP3994 Dilute to 1x and filter or autoclave prior to use.
Methyl-β-Cyclodextrin Sigma Life Science C4555-10G Dissolve in 1x PBS to make solutions of 10mM and 30mM concentrations
Orbital Shaker Labline
Amplex Red Cholesterol Assay Kit Life Technologies Molecular Probes A12216 All reagents for Cholesterol Assay are contained within the kit. Follow Manufacturer instructions.
96-Well Black Assay plate Corning Inc. Costar 3603
FilterMax microplate reader Molecular Devices Model F5
TLC Chamber Sigma-Aldrich Z126195-1EA
Chloroform Sigma-Aldrich 650498-4L
Methanol Sigma-Aldrich 34860-2L-R
TLC Paper Whatman 3030917 Cut down to size needed for TLC tank
Fume Hood Any fume hood that complies with AIHA/ANSI Standards 
6-Well Plate Corning Inc. Costar 3506
Trypsin-EDTA Gibco 25300-054
Cell Scraper Corning Inc. Costar 3010
Hemocytometer  Hausser Scientific 1490
Centrifuge Beckman Coulter Model Alegra x-30R
Votex Mixer Fisher Scientific 12-812
Balance Mettler Toledo Model # MS104S Meaures down to .1 mg
Glass Pasteur Pipette Fisherbrand 13-678-20A
Cholesterol Avanti Polar Lipids 700000
SpeedVac Concentrator Thermo Scientific Model # SPD2010 
Petroleum Ether Fisher Scientific E139-1 
Diethyl Ether Sigma-Aldrich 309966 
Acetic Acid Sigma-Aldrich 320099
TLC Silica Gel 60 with concentrating zone Analytical Chromatograhy Millipore 1.11845.0001
Iodine Chips Sigma-Aldrich 376558-50G
Sulfuric Acid Sigma-Aldrich 320501 
Manganese Chloride Sigma-Aldrich 244589
UVP EC3 Imaging System Ultra-Violet Products Ltd. Use the Vision Works LS software for densitometry analysis
Glass Bottom Confocal Dish MatTek P35G-1.5-10C www.glassbottomdishes.com
Cryptococcus neoformans (H99) Obtained from Duke University Medical Center
YNB BD 239210 See manufacturer for preparation instructions. Use a Glucose concentration of 20 g/L.
Lipopolysaccharide Sigma L4391-1MG Dissolve in 1x PBS to make 1mg/mL stock. Store at -20 °C.
Interferon gamma Sigma I4777 Dissolve in 1x PBS to make .1 mg/mL stock solution
Glucuronoxylomannan antibody (anti-GXM) Gift from Arturo Casadevall's Lab concentration is 1.98 mg/mL
Giemsa MP Biomedicals 194591 Dissolve .8 g of Giemsa in 25 mL of Glycerol and heat to 60 °C for 1 hour. Add 25 mL of methanol to the solution and allow to age at room temperature for at least 1 month.
Microscope Zeiss Observer.D1 microscope with AxioCam MRm for taking images

References

  1. Sarantis, H., Grinstein, S. Subversion of phagocytosis for pathogen survival. Cell Host & Microbe. 12 (4), 419-431 (2012).
  2. Rougerie, P., Miskolci, V., Cox, D. Generation Of Membrane Structures During Phagocytosis And Chemotaxis Of Macrophages: Role And Regulation Of The Actin Cytoskeleton. Immunological Reviews. 256 (1), 222-239 (1111).
  3. Liu, T., Perlin, D. S., Xue, C. Molecular Mechanisms Of Cryptococcal Meningitis. Virulence. 3, 173 (2012).
  4. Abadi, J., Pirofski, L. A Antibodies Reactive With The Cryptococcal Capsular Polysaccharide Glucuronoxylomannan Are Present In Sera From Children With And Without Human Immunodeficiency Virus Infection. The Journal Of Infectious Diseases. 180 (3), 915-919 (1999).
  5. Kechichian, T. B., Shea, J., Del Poeta, M. Depletion Of Alveolar Macrophages Decreases The Dissemination Of A Glucosylceramide-Deficient Mutant Of Cryptococcus Neoformans In Immunodeficient Mice. Infection And Immunity. 75 (10), 4792-4798 (2007).
  6. Casadevall, A. Cryptococci At The Brain Gate: Break And Enter Or Use A Trojan Horse. The Journal Of Clinical Investigation. 120 (5), 1389-1692 (1172).
  7. Chrétien, F., et al. Pathogenesis Of Cerebral Cryptococcus Neoformans Infection After Fungemia. The Journal Of Infectious Diseases. 186 (4), 522-530 (2002).
  8. Luberto, C., Martinez-Mariño, B., et al. Identification Of App1 As A Regulator Of Phagocytosis And Virulence Of Cryptococcus Neoformans. The Journal Of Clinical Investigation. 112 (7), 1080-1094 (1172).
  9. Mcquiston, T. J., Williamson, P. R. Paradoxical Roles Of Alveolar Macrophages In The Host Response To Cryptococcus Neoformans. Journal Of Infection And Chemotherapy: Official Journal Of The Japan Society Of Chemotherapy. 18 (1), 1-9 (2012).
  10. García-Rodas, R., Zaragoza, O. Catch Me If You Can: Phagocytosis And Killing Avoidance By Cryptococcus Neoformans. FEMS Immunology And Medical Microbiology. 64 (2), 147-161 (2012).
  11. Coelho, C., Bocca, A. L., Casadevall, A. The Intracellular Life Of Cryptococcus Neoformans. Annual Review Of Pathology. 9. 219, 10-1146 (2014).
  12. Rao, M., Peachman, K. K., Alving, C. R., Rothwell, S. W. Depletion Of Cellular Cholesterol Interferes With Intracellular Trafficking Of Liposome-Encapsulated Ovalbumin. Immunology And Cell Biology. 81, 415-423 (2003).
  13. Sein, K. K., Aikawa, M. The Prime Role Of Plasma Membrane Cholesterol. In The Pathogenesis Of Immune Evasion And Clinical Manifestations Of Falciparum Malaria. Medical Hypotheses. 51 (2), 10-1016 (1998).
  14. Pucadyil, T. J., Tewary, P., Madhubala, R., Chattopadhyay, A. Cholesterol Is Required For Leishmania Donovani Infection: Implications In Leishmaniasis. Molecular And Biochemical Parasitology. 133, 145-152 (2004).
  15. Tagliari, L., et al. Membrane Microdomain Components Of Histoplasma Capsulatum Yeast Forms, And Their Role In. Alveolar Macrophage Infectivity. Biochimica Et Biophysica Acta. 1818 (3), 458-466 (2012).
  16. Crane, J. M., Tamm, L. K. Role Of Cholesterol In The Formation And Nature Of Lipid Rafts In Planar And Spherical Model Membranes. Biophysical Journal. 86 (5), 2965-2979 (2004).
  17. Brown, D. A., London, E. Functions Of Lipid Rafts In Biological Membranes. Annual Review Of Cell And Developmental Biology. 14, 111-136 (1998).
  18. Simons, K., Toomre, D. Lipid Rafts And Signal Transduction Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 1 (1), 31-39 (2000).
  19. Ilangumaran, S., Hoessli, D. C. Effects Of Cholesterol Depletion By Cyclodextrin On The Sphingolipid Microdomains Of The Plasma Membrane. The Biochemical Journal. 335 (Pt 2), 433-440 (1998).
  20. Bligh, E. G., Dyer, W. J. A Rapid Method Of Total Lipid Extraction And Purification). Canadian Journal Of Biochemistry And Physiology. 37 (8), 911-917 (1959).
  21. Mukherjee, S., Lee, S., Casadevall, A. Antibodies To Cryptococcus Neoformans Glucuronoxylomannan Enhance Antifungal Activity Of Murine Macrophages. Infect. Immun. 63 (2), 573-579 (1995).
  22. Deshaw, M., Pirofski, L. A. Antibodies To The Cryptococcus Neoformans Capsular Glucuronoxylomannan Are Ubiquitous. In Serum From HIV+ And HIV- Individuals. Clinical And Experimental Immunology. 99 (3), 425-432 (1995).
  23. Tripathi, K., Mor, V., Bairwa, N. K., Del Poeta, M., Mohanty, B. K. Hydroxyurea Treatment Inhibits Proliferation Of Cryptococcus Neoformans In Mice. Frontiers In Microbiology. 3, 187 (2012).
  24. Chaka, W., et al. Quantitative Analysis Of Phagocytosis And Killing Of Cryptococcus Neoformans By Human Peripheral Blood Mononuclear Cells By Flow Cytometry. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2 (6), 753-759 (1995).

Play Video

Cite This Article
Bryan, A. M., Farnoud, A. M., Mor, V., Del Poeta, M. Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans. J. Vis. Exp. (94), e52432, doi:10.3791/52432 (2014).

View Video