Virus de la grippe Propagation dans embryonnés de poulet Oeufs
Summary
Fertile chicken eggs are widely used to produce large amounts of human influenza A virus as they provide a convenient and cost-effective system to prove high yields of virus.
Abstract
L'infection grippale est associée à environ 36 000 morts et plus de 200 000 hospitalisations chaque année aux États-Unis. L'émergence continue de nouvelles souches de virus de la grippe en raison de la mutation et de réassortiment complique le contrôle du virus et nécessite le développement permanent de nouveaux médicaments et vaccins. L'étude de la grippe en laboratoire nécessite une méthode fiable et rentable pour la propagation du virus. Ici, un protocole complet est fourni pour la grippe A propagation des virus dans des œufs de poule fertiles, ce qui donne toujours des stocks viraux à titre élevé. En bref, le sérum (SPF) des œufs de poule fécondés exempts d'agents pathogènes sont incubées à 37 ° C et 55-60% d'humidité pendant 10 à 11 jours. Sur cette période, le développement de l'embryon peut être facilement contrôlé en utilisant un candler d'oeuf. Virus inoculation est effectuée par injection de stock de virus dans la cavité allantoïque en utilisant une aiguille. Après 2 jours d'incubation à 37 ° C, les oeufs sontréfrigérés pendant au moins 4 heures à 4 ° C. La coquille d'oeuf au-dessus de la poche d'air et la membrane chorio-allantoïde sont ensuite ouvert avec précaution, et le fluide allantoïque contenant le virus est récolté. Le liquide est éliminé de débris par centrifugation, aliquoté et transféré à -80 ° C pour stockage à long terme. La grande quantité (5-10 ml de liquide par oeuf contenant virus) titre et de haute virus qui est habituellement obtenue avec ce protocole a fait l'utilisation d'œufs pour la préparation de virus notre méthode favorable, en particulier pour les études in vitro qui nécessitent de grandes quantités de virus où des dosages élevés de la même stock de virus sont nécessaires.
Introduction
La grippe A continue d'être une menace majeure pour la santé humaine. Ce est une maladie respiratoire potentiellement dévastatrice avec une grande charge mondiale causant jusqu'à 500 000 décès dans le monde chaque année 1. Les virus grippaux sont dans la famille des Orthomyxoviridae et portent huit sens négatif ARN simple brin dans leur génome 1,2. La haute mutabilité (ce est à dire, "dérive" antigénique) du génome viral empêche immunité à long terme. En outre, la grippe est de plus en plus résistantes aux médicaments anti-viraux 3.
La pandémie de grippe H1N1 2009 a mis en évidence toutes les questions difficiles associés à la maladie de la grippe (souche pandémique, la résistance anti-virale, la production de vaccins retardé). La formulation de vaccin est déterminé annuellement par l'Organisation mondiale de la santé pour les souches de la grippe les plus susceptibles pathogènes (un pour chaque H1N1, H3N2 et la grippe B) 4. Parce que cette méthode est basée sur la souche de grippe annoncées, les souches pathogènes sont parfois mal identifiés et l'efficacité du vaccin diminue considérablement. En outre, l'apparition de nouvelles souches de la grippe peut contourner ces programmes de prévention en cas de pandémie provoquant la maladie 2.
La création d'un vaccin contre la grippe universelle a été difficile à atteindre 5. Par conséquent, la recherche doit se poursuivre dans la compréhension de la pathogenèse des lésions pulmonaires. Pour la recherche en laboratoire de l'installation, plusieurs méthodes ont été développées pour l'isolement du virus et la propagation 6. Virus de la grippe humaine peuvent être amplifiés dans une variété de substrats de cellules de mammifères. Cependant, générant virus de titre élevé en grandes quantités sont mieux atteints dans des oeufs embryonnés. Le protocole suivant décrit une technique pour la grippe A propagation du virus et le stockage de stocks de virus existants.
Protocol
Representative Results
Discussion
L'influenza cause une grande charge mondiale de morbidité, et le travail se poursuit dans la compréhension de la pathogenèse des lésions pulmonaires 7. Pour la recherche facilitée dans cette maladie mortelle, diverses méthodes ont été développées pour propager le virus de la grippe 6. Ici, nous décrivons une technique pour produire des virus de la grippe dans les oeufs de poulet. L'avantage de cette méthode est qu'il est hautement reproductible et se traduit par de grandes q…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The present study was supported by the NIH grants HL120947 (P.C.), HL103868 (P.C.), and the American Heart Association Grant-in-Aid (P.C.)
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Cellgro | 21-040-CV | |
| serum pathogen-free (SPF) fertilized chicken eggs | VALO BioMedia | n/a | |
| humidified egg incubator | FARM iNNOVATORS | Model 2100 | |
| automatic egg turner | FARM iNNOVATORS | Model 3200 | |
| egg candler | FARM iNNOVATORS | Model 3300 | |
| 1 ml syringe | BD Bioscience | 309659 | |
| 18G needle | BD Bioscience | 305196 | |
| 20G / 22G needle | BD Bioscience | 305176 / 305156 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Ethanol, >99.5% | Sigma-Aldrich | 459844 | diluted to 70% using water |
| glue gun "Ad tech Hi Temp Project Pro" | Ad tech, Adhesive Technologies, Inc. | Model 1105 | |
| glue "Ad tech MINI SIZE, Multi Temp" | Ad tech, Adhesive Technologies, Inc. | 220-34ZIP30 | |
| MDCK cells | ATCC | CRL-2935 | |
| Washed Pooled Turkey Red Blood Cells, 10% | Lampire Biological Laboratories | 724908 |
References
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