A PCR-based protocol was adapted to detect Cronobacter spp., Salmonella enterica, and Listeria monocytogenes from body surfaces and alimentary canals of individual wild-caught flies. The goal of this protocol is to detect and isolate bacterial pathogens from individual insects collected as part of an environmental sampling program during foodborne outbreak investigations.
There is unanimous consensus that insects are important vectors of foodborne pathogens. However, linking insects as vectors of the pathogen causing a particular foodborne illness outbreak has been challenging. This is because insects are not being aseptically collected as part of an environmental sampling program during foodborne outbreak investigations and because there is not a standardized method to detect foodborne bacteria from individual insects. To take a step towards solving this problem, we adapted a protocol from a commercially available PCR-based system that detects foodborne pathogens from food and environmental samples, to detect foodborne pathogens from individual flies.Using this standardized protocol, we surveyed 100 wild-caught flies for the presence of Cronobacter spp., Salmonella enterica, and Listeria monocytogenes and demonstrated that it was possible to detect and further isolate these pathogens from the body surface and the alimentary canal of a single fly. Twenty-two percent of the alimentary canals and 8% of the body surfaces from collected wild flies were positive for at least one of the three foodborne pathogens. The prevalence of Cronobacter spp. on either body part of the flies was statistically higher (19%) than the prevalence of S. enterica (7%) and L.monocytogenes (4%). No false positives were observed when detecting S. enterica and L. monocytogenes using this PCR-based system because pure bacterial cultures were obtained from all PCR-positive results. However, pure Cronobacter colonies were not obtained from about 50% of PCR-positive samples, suggesting that the PCR-based detection system for this pathogen cross-reacts with other Enterobacteriaceae present among the highly complex microbiota carried by wild flies. The standardized protocol presented here will allow laboratories to detect bacterial foodborne pathogens from aseptically collected insects, thereby giving public health officials another line of evidence to find out how the food was contaminated when performing foodborne outbreak investigations.
Onlar yiyecek veya gıda ile temas eden yüzeyleri ve eşyaları 1 patojenleri yayılabilir, çünkü böcekler yiyecek-ilişkili hastalıkların bulaşmasında önemli rol oynar. Böcekler arasında, sinekler hamamböceği ve karıncalar gıda kaynaklı patojenlerin yayılmasını tercih davranışlar sergilerler. Bu davranışlar çöp ve dışkı, endophily (giren binalar), ve synanthropy (insanlar ile birlikte yaşayan), çürüyen madde ile bir ilişki bulunmaktadır 2. .. Salmonella spp gibi gıda kaynaklı patojenler, Listeria monocytogenes, Campylobacter spp Escherichia coli O157: H7, ve cins Cronobacter (eski Enterobacter sakazakii'nin) üyeleri böcekler 3-5 iletilecek bildirilmiştir. Synanthropic pislik mekanik onların kontamine vücut yüzeylerinden patojenleri aktararak gıda kaynaklı bakteri yayılır sinekler. Bununla birlikte, sinekler, sindirim borusu içinde gıda ile taşınan patojenlerin varlığı ile üç kez kadar olabilirvücut yüzeyleri (vücut, baş, bacaklar ve kanatlar) 5 gözlenen daha büyük. Gıda kaynaklı patojenler de vücut yüzeyi 6,7 ziyade ve bazı durumlarda süre daha uzun süreyle sineğin sindirim kanalında kalabilir, bunlar sineğin sindirim yolu 4,8,9 kolonize, çarpma edebiliyoruz. Onlar daha dışkılama ve regürjitasyon 10,11 ile gıda kaynaklı patojenler yayılabilir çünkü bu sinekler vektör potansiyelini arttırır.
Günümüzde, daha hızlı gıda kaynaklı hastalık salgınları tespit edebiliyoruz gözetim sistemleri var geliştirilmiştir. Gıda kaynaklı salgın soruşturma yapılırken, kamu sağlığı yetkilileri enfeksiyon kaynağı (ler) veya araç (lar) olabilir gıda için bakmak. Araştırmacılar ayrıca, gıda kirlenmiş öğrenmek için ilgili tesis (veya tesislerin) bir çevresel değerlendirme yapabilir ve soruşturma 12 kapsamında örnekleri toplamak olabilir. DespBilimsel literatürde, gıda kaynaklı patojenlerin taşıyıcıları olarak böceklerle ilgili belirli bir gıda kaynaklı hastalık salgını zorlu olmuştur neden olan patojen vektörleri gibi böcekler bağlayan büyük miktarda ite. Böcekler aseptik gıda kaynaklı salgın soruşturmalar sırasında çevre örnekleme programlarının bir parçası olarak tahsil edilmemesi Bunun başlıca nedeni olduğunu. Böcekler, çevre örnekleme prosedürü, bir tek böcek yerde olması gerekir gelen gıda kaynaklı patojenlerin tespit etmek için bir standart hızlı, hassas ve güvenilir bir protokol kapsamında, gıda kaynaklı patojenlerin yayılmasını lehine davranışlar sergilediği özellikle de dahil etmek.
Böceklerden gıda kaynaklı patojenlerin saptanması için geleneksel kaplama teknikleri zahmetli ve böceğin doğal ortakçı mikrobiyota hızlı büyümesini üstesinden gelmek için, farklı kültür ortamı içinde, hedef bakteri rekabetçi büyüme bağlıdır. Ba ile böcekleri ilişkili çalışmaların çoğucterial patojenler birlikte birkaç böcekler havuzu ziyade bireysel bazda başına patojenlerin varlığı tespit ederek yöntemin duyarlılığını artırmıştır. Böylece, bu çalışmalar patojenler 13-18 bulundu böceğin vücut parçası ayırt etmedi. Bu epidemiyolojik etkileri olabilir ve farklı azaltma stratejileri yol açabilir gibi gıda kaynaklı patojenler vücut yüzeyinde veya bireysel böceğin sindirim kanalında bulunan olup olmadığını belirlemek için yeteneği önemlidir. Mekanik vektörleri olarak, sadece enfeksiyonun potansiyel olarak daha yüksek seviyelerde aktarma patojenlerin olasılığını arttırmak akmak bu sinekler ise, vücut yüzeyinden bakteri düşük seviyelerde transferi ve gıda dışkılama olabilir kısa bir süre için gıda araziyi uçar. Sonuç olarak, bir birey böcek başına bir gıda kaynaklı patojen prevalansını tahmin etmek ve bu böcek bakteriyel p vücut parçası ayırt etmek önemlidir athogen bulunmaktadır.
Gıda kaynaklı patojenleri saptamak için kültür-bağımsız yöntemlerin kullanılması giderek yürütülmektedir olsa, onlar ticari bir tek böcek gıda kaynaklı patojenlerin tespit etmek için kullanılan değil. Şu anda, ticari, sanayi ve düzenleyici kurumlar tarafından kullanılmakta olan gıdalardan gıda kaynaklı patojenlerin hızlı tespiti için kullanılabilir moleküler protokolleri var doğrulanır. Bu yöntemler, gıda örnekleri çeşitli patojenlerin saptanması için DNA bazlı sistemler yer alır. Moleküler protokoller, geleneksel kaplama yöntemlerine göre daha hızlı olsa da, örnek zenginleştirilmesi hala polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) 'de gerekli olan bakteriyel patojen 10 2 koloni oluşturan birim (CFU) tabanlı yöntemler 19 duyarlılık seviyesinin elde edilmesi için gereklidir. Buna ek olarak, PCR pozitif numuneler saf bakteri kolonilerinin izolasyon uygun yöntemler kullanılarak patojen teyit etmek için gereklidir.
İçerik "> Bu protokolün amacı, vücut yüzeyinden gıda kaynaklı bakterilerin tespiti ve tek sinek sindirim kanalına gıda ve çevresel örneklerden patojenleri tespit etmek ve daha fazla olanlar izole etmek için kullanılan bir piyasada mevcut PCR tabanlı bir sistemin standardize etmek Burada tarif edilen protokol samples.The hassasiyeti patojenlerin ilk deneysel her bir bakteri patojeninin seri seyreltileri ile beslenen hayvanlar lab-destekli yetişkin ev sinekleri (Musca domestica) ile kalibre edilmiştir. standart bir protokol, daha sonra incelemek için kullanılmıştır 100 vahşi yakalanmış vücut yüzeyleri ve / veya sindirim kanallarından gıda kaynaklı patojenlerin varlığı için uçar. Bu standart bir protokol halk sağlığı laboratuarları gıda kaynaklı yaparken çevresel örnekleme programının bir parçası olarak toplama imkanı sağlayarak, böcekler tarafından yöneltilen sağlık tehditleri tespit sağlayacak salgın incelemeleri.Doğru gıdalar veya gıda ile ilgili ortamlarda 13,15 tek sinek varlığı gıda ile ilgili riski değerlendirmek için gerekli bilgileri içerir olmayabilir protokolleri büyük bir çeşitlilik kullanmış yabani böceklerin gıda kaynaklı patojenlerin tespit ettik Önceki çalışmalar, 23,24. Burada, bu standart protokol kullanılarak, tespit ve Cronobacter spp mümkün olduğunu göstermiştir. S. enterica ve L. vücut yüzeyi ve vahşi yakalanmış tek sinek sindirim kanalına monocytogenes. Böcekler hedef gıda kaynaklı patojen düşük numaraları ve diğer yerli Mikrobiyota 25,26 yüksek sayıda taşıyabilir, çünkü bu protokol hedef gıda kaynaklı patojen tespit hassasiyetini artırmak için belirli bir kültür ortamında örneklerin birincil (ve bazen ikincil) zenginleştirme gerektirir . PCR bazlı tespit sistemi ile ilgili sonuçlar deterjanları için (yaklaşık olarak 30 saat içinde elde edildiCronobacter spp ölü m. ve S. enterica) ve ilk olarak numune işleme sonrası L. monocytogenes) saptanması için 48 st (. Böylece, bu protokol, güvenilir hem hızlı ve gıda ile taşınan patojenlerin varlığı için bir sinek taranması için yeterince hassastır.
Canlı bakteri PCR pozitif sonuçların doğrulanması ve izolasyon bir çok laboratuarda standart dışı çalışma prosedürün bir parçasıdır. Buna ek olarak, epidemiyolojisi amacıyla PCR-pozitif numunelerinin saf bakteri kültürleri daha onaylamak ve biyokimyasal, bağışıklık veya genetik yöntemlerle gıda kaynaklı patojen serotipine gerekmektedir. Hiçbir yanlış pozitif gözlenmiş olmasına rağmen S. tespit ettiğinde enterica ve L. Tek vahşi yakalanmış sinekler vücut bölgelerinden monocytogenes, bu protokolü kullanarak, biz Cronobacter spp yanlış pozitif% 50 oranına kadar buldum. Bu durum, cins Cronobact için PCR bazlı tespit sistemier sinekler tarafından taşınan son derece karmaşık Mikrobiyota arasında mevcut diğer Enterobacteriaceae ile çapraz-reaksiyona girebilir. Böylece, izolasyon ve PCR-pozitif örneklerden cins Cronobacter saf kolonilerin arıtma değerlendirilen diğer patojenlerin daha seçici kaplama gerektirir.
Bu protokol, öncelikle Cronobacter spp varlığı için bireysel vahşi yakalanmış sinekler taramak için standardize edilmiştir. S. enterica ve L. ticari bir PCR bazlı tespit sistemi kullanılarak monocytogenes. H7 (ya E. coli O157 kullanarak: H7 MP standart deney seti veya E. coli Ancak, bu protokol de kolayca enterohemorrhagic E. coli O157 gibi diğer gıda kaynaklı patojenlerin varlığı için tek sinek vücut parçaları taramak için uyarlandı O157: Gerçek zamanlı tahlil kiti H7) ve shiga-toksijenik E. yayından coli (STEC) grubu (gerçek-zamanlı STEC paketi kullanarak), elde duyarlılıkları>% 80 (ed verileri). Ayrıca, bu protokol potansiyel hastalıklar (hamamböceği ve karıncalar) vektörler bilinen diğer böceklerden gıda kaynaklı patojenlerin tespit etmek için adapte edilebilir, ancak bu alanda daha fazla araştırmaya ihtiyaç vardır.
Gıda kaynaklı hastalık salgını soruşturma çok dinamik ve özel durum ve yerel olmak ortam 12,27 araştırıldı göre değişebilir bir çok adım süreci içermektedir. Gelecek hastalıkların önlenmesi ile anında halk sağlığı koruma sağlamak çünkü bu araştırmalar önemlidir. Ayrıca, bu araştırmalar gıda kaynaklı mikroorganizmalar yayılır hangi yeni mekanizmaları aydınlatmak ve araştırma 28 için yeni alanlara yol önemli soruları gündeme olabilir. Soruşturma teknikleri yanı sıra, standart, hızlı ve hassas protokoller bireysel böceklerden gıda kaynaklı patojenlerin tespiti için gereklidir. Bu standart bir protokol w, aseptik sinek gibi böcekler toplamak için fırsat açarhich bir çevre örnekleme programının bir parçası olarak, gıda kaynaklı patojen bakteri vektör olabilir. Bu elde edilebilir epidemiyolojik bilgiler böcekler tarafından gıda kaynaklı patojenlerin bulaşma mekanizmaları doğru bir resim yapımında kullanılmak olacaktır (yani, pozlama süresi: açılış sinekler karşı iniş tuvaletimi ve regurgitating bir sinek).
Hayır sadece uygun sistemi yoluyla Son olarak, burada açıklanan ticari PCR-tabanlı algılama sistemi kullanmak için pratik ve PCR ve cins düzeyinde amplikonunu görselleştirme kolaylaştırır olsa, öyle. zenginleştirilmiş örneklerden lizat alternatif olarak kamuya açık olabildiği için, türe özgü primer çiftleri kullanılarak gıda kaynaklı Patojenlere taranması için kullanılabilir. Bununla birlikte, algılama hassasiyeti, kullanmadan önce gösterilmelidir.
The authors have nothing to disclose.
Thanks to Ben D. Tall, Yi Chen, and Thomas Hammak from the U.S. Food and Drug Administration (FDA), Center for Food Safety and Applied Nutrition (CFSAN) for critically reviewing the manuscript. The authors also thank Hannah Lee (research internship program, Joint Institute for Food Safety and Applied Nutrition (JIFSAN), University of Maryland) for laboratory assistance and David Weingaertner (FDA, CFSAN) for preparing the figure of the schematic overview shown in the video.
Bismuth sulfite (BS) agar | Fisher Scientific | R452402 | *Multiple suppliers. |
Brain heart infusion (BHI) broth | Becton, Dickson and Company | 299070 | *Pre-warmed to 37°C. Multiple suppliers. |
Brilliance Listeria agar (BLA) | Fisher Scientific | CM1080B | *Multiple suppliers. |
Buffered peptone water (BPW) | Becton, Dickson and Company | 212367 | *Pre-warmed to 37°C or 42°C. Multiple suppliers. |
Brilliance Cronobacter agar (Druggan-Forsythe-Iversen formulation/DFI) | Fisher Scientific | CM1055B | *Multiple suppliers. |
chromID Sakazakii Agar | bioMérieux | 43741 | *Call for information: 800.682.2666 |
R & F Enterobacter sakazakii (Cronobacter) Chromogenic Plating Medium | R & F Laboratories | Various | *Call for information: +1.630.969.530 |
R & F Enterobacter sakazakiii Enrichment Broth and supplement | R & F Laboratories | Various | *Call for information: +1.630.969.530 |
Hektoen enteric (HE) agar | Fisher Scientific | OXCM0419B | *Multiple suppliers. |
24 Listeria enrichment broth (24LEB) | Oxoid | CM1107 | *Freshly prepared at room-temperature. Multiple suppliers. |
Listeria selective enrichment supplement | Oxoid | SR0243 | *Multiple suppliers. |
Novobiocin | Fisher Scientific | OXSR0181E | *Multiple suppliers. Store at 2-8 °C |
Vancomycin hydrochloride hydrate | Sigma Aldrich | 861987 | Store at 2-8 °C |
Cefsulodin sodium salt hydrate | Sigma Aldrich | C8145 | Store at 2-8 °C |
Rappaport-Vassiliadis (RV) medium | Fisher Scientific | CM0669B | *Multiple suppliers. |
Tetrathionate (TT) Broth | Becton, Dickson and Company | 249120 | *Multiple suppliers. |
Trypticase soy agar (TSA) | Becton, Dickson and Company | 236930 | *Multiple suppliers. |
Xylose lysine desoxycholate (XLD) agar | Becton, Dickson and Company | 221284 | *Multiple suppliers. |
API Biochemical identification system | bioMérieux | Various | *Call for information: +1.800.682.2666 |
VITEK 2: Product Safety | bioMérieux | Various | *Call for information: +1.800.682.2667 |
BAX System Q7 | DuPont | N/A | |
BAX E. sakazakii Standard assay kit | DuPont | D11801836 | * |
BAX L. monocytogenes 24E assay kit | DuPont | D13608125 | * |
BAX Salmonella 2 Standard assay kit | DuPont | D14368501 | * |
Capping tool | DuPont | D11677028 | |
Decapping tool | DuPont | D11134095 | |
PCR tube rack/holder | DuPont | D12701663 | |
Featherweight forceps, wide tip | BioQuip | 4750 | Sterilize before use. Multiple suppliers. |
Fine point, straight tip forceps | BioQuip | 4731 | Sterilize before use. Multiple suppliers. |
Zirconia/silica beads, 0.5 mm | Bio Spec Products, Inc. | 11079105z | Multiple suppliers. |
Petri dishes – 60X15mm | Fisher Scientific | 08-772B | Multiple suppliers. |
Disposable inoculating loops, 10µL | Fisher Scientific | 22-363-606 | Multiple suppliers. |
L-shaped cell spreaders | Fisher Scientific | 14-665-230 | Multiple suppliers. |
Microcentrifuge tubes, 2 ml | Fisher Scientific | Various | Sterilize before use when needed. Secure lid is preferred. Multiple suppliers. |
Cluster tubes | Fisher Scientific | 05-500-13 | |
Cluster tubes caps | Fisher Scientific | 05-500-23 | |
Sodium hypochlorite (Liquid chlorine bleach) | N/A | N/A | *Dilute to 0.05% with water. Multiple suppliers. |
Sterile deionized water | N/A | N/A | Multiple suppliers. |
Sterile distilled water | N/A | N/A | Multiple suppliers. |
Ethyl alcohol 190 proof | N/A | N/A | *Dilute to 70% with water when needed. Multiple suppliers. |
Genie cell disruptor, 120V – for 1.5ml and 2.0ml microtubes | Scientific Industries, Inc. | SI-D238 | Multiple suppliers. |
Heating block | N/A | N/A | Multiple suppliers. |
Cooling block | N/A | N/A | Multiple suppliers. |
Recirculating water bath | N/A | N/A | Multiple suppliers. |
Stereo microscope | N/A | N/A | Multiple suppliers. |
Centrifuge | N/A | N/A | Multiple suppliers. |
Incubator | N/A | N/A | Multiple suppliers. |