Here we present a protocol outlining how to sample wooden specimens for the overall assessment of their growth structures. Macro- and microscopic preparation and visualization techniques necessary to generate well-replicated and highly resolved wood anatomical and dendroecological dataset, are described are described.
Dendroecological研究使用存储在树木年轮资料,以了解单棵树,甚至整个森林生态系统应对环境变化,并最终重建这种变化。这是通过分析生长变化回在时间和相关联的各种植物的具体参数(例如)温度记录完成。集成在这些分析的木材解剖参数将加强重建,甚至是内部年度决议。因此,我们提出,关于如何进行采样,准备,和分析木试样为普通宏观分析,而且还用于随后的微观分析的协议。此外,我们还引进了分析,从常见的小型和大型标本产生的数字图像,支持时间序列分析潜在的解决方案。该协议提出了基本步骤目前可以使用它们。除此之外,有一个持续的需要对现有技术的提高,以及新吨发展echniques,记录和量化过去和目前环境的进程。传统的木材解剖学研究需要扩大到包括生态资料,这一领域的研究。这将支持dendro科学家谁打算来分析新的参数,并开发新的方法,以了解具体的环境因素对木本植物的解剖结构的短期和长期影响。
树木,以及灌木,侏儒灌木,甚至草药,显示与环境变化的歧管的反应模式。中期以来,19 世纪这些模式一直受到植物学和植物生理学。在那时,对木本植物研究主要集中在树的结构和年轮变异性的生态环境1的描述性分析。当安德鲁埃利科特道格拉斯发明了树木年轮研究2交叉测年技术,这种生态环境中或多或少地受到精确迄今为止发现的木考古的新功能抑制。跨约会,第一次使树木年轮历年的准确约会,并一直到现在视为树轮研究中的应用1的各个领域的中坚力量。
与此同时,自19世纪末,木材解剖演变成一个重要的研究学科相关d可自然与应用科学3等诸多领域。两个主要的结构域被建立:系统木材解剖,这是基础识别木材在考古学4,并且施加木材解剖,涉及到木技术,生理,病理,和生态学3,5。
在树轮研究,dendroecology现今被定义为一个主题涵盖年轮相关的研究集中在环境研究如地貌过程(dendrogeomorphology),温度和降水重建(dendroclimatology),水位变化(dendrohydrology)或甚至冰川波动( dendroglaciology)6。作为该定义表示,年轮分析已成为在约会和重建的环境工艺领域日益重要,如(ⅰ)过去的气候条件下,通过分析在环宽度7,8,木材密度9年变化或同位素10,或(二)T他复发地貌过程11的区间。这些关于环宽度的变化和它们的同位素含量非常详细的研究表明,有必要分析环中更详细地说, 也就是 ,要研究的环的解剖结构。然而,有关环境变化的年轮内木材解剖学特征的详细研究并不多见12,13。虽然这些微观特征是已知的14,它们很少被应用在微观水平dendroecological研究。此外,在自然生长的树木,进行精确测的目的必不可少的,这些增长反应的精确定时,很少被最近15记录。
关于全球变暖16的影响,现有的和新的技术发展的提高,以记录和量化是必需的过去和目前的环境过程,特别是在气候影响研究11表示。通过扩大传统的木材解剖学研究的基于生态木材解剖17,dendro科学家可以分析新的参数,并开发新的方法,以了解具体的环境因素对木本植物18的解剖结构的短期和长期影响。有关变化与特定的驱动程序( 例如 ,机械力,气候变化)个人五环内不同的细胞参数的详细知识是理解年轮形成变异的基本要求。相比普通环宽度的测量,确定木材解剖变异要求需要大量的劳力和时间的更复杂和更广阔的制备技术。的试样切割,染色,和嵌入的详细过程是多方面的和总是依赖于研究19的目的。
对于环宽的针叶树,甚至结构数量,规模还是颇宏观分析船舶在硬木ibution,样品的表面用细砂纸或专用磨床20通常抛光。这个程序的一个缺点是各个单元与灰尘,防止进一步的半自动显微分析21的填充。对于宏观样品制备的最好的结果是当样品表面被用剃刀刀片或其他锋利的刀切割实现。
而对于小样本,刀片是一个完美的工具;更大的样本作为核所需要的平面表面在芯的整个程度的切割。在对比砂光,将细胞没有填充尘埃,这使进一步制备为连续图像分析。此外,开孔管腔,所述适当切细胞壁,并且将整个样品的平面表面使高频密度22到芯的整个范围中的应用。为图像分析,将样品的表面(小区壁)可以使用深色墨水进行染色和开孔管腔随后可以填充有白粉笔增强细胞壁和管腔面积19,23之间的对比度。这个相当简单的技术实现了较大的细胞结构容器三围尺寸基本宏观评估。
这些技术用于切割平面的表面是足够用于宏观分析。一个详细的木材解剖( 即微观)分析,透射光显微术是在dendro科学应用中最常用的方法。通过复杂的过程包含细胞类型测定,细胞分裂,细胞分化木质部细胞分化,和程序性细胞死亡24。由于在发生这些过程确定细胞解剖特点的定时和速率,影响这些过程的环境条件下能产生在环结构中解剖偏差。作为这些分析的重要先决条件S,微段需要被用切片机19制得。当制备样品切片,管胞或纤维方向的可见性是至关重要的。利用手驱动的滑动切片机的建议削减微型部分,因为这种技术有利于高品质的路段根据需要进行图像分析19。根据某研究的具体目的,微切片切成垂直于或平行于电池的纵向范围。这些部分再拍下显微镜下面,并使用专门的图像测量单元的尺寸分析软件。
直到最近,以制备微切片的能力被限制在小样本大小只(约1cm×1厘米)。这是可以接受的,分析单个事件在特定年紊乱,但这种技术不允许所需环境重建扩展时间序列分析。这项工作只能实现通过对新型,高效,经济的准备过程和分析技术的发展ð。近年来,在瑞士联邦研究所WSL瑞士树木年轮实验室的成员已经开始对这个话题深入细致的工作。其结果是,新的设备和分析技术已被开发以支持整合木材解剖特征来广泛的环境研究课题的想法。
木材解剖的成功和可持续一体化的挑战转化为dendroecological的研究是,除了多方面的分析问题,主要是由于技术方面的问题。这些挑战包括从原则抽样方法,以创造高品质的微型部分及其后续分析19。
乍一看,核心甚至光盘的采样是已经知道了很多年,现在一个简单的过程。有迹象表明,可以做错误和一个小的不准确的采样会导致在随后的制备和分析阶段严重问题很多事情。小的不准确,如核化是不完全垂直于杆轴或使用不完全削尖取样器不是一个问题,如果该研究的目的是限制在环宽度的测量。然而,目标是样品的显微分析时,不正确的采样方向可能导致光学畸变细胞壁,而使用钝取样器的结果在芯内的微裂纹。其结果是,试图削减这些内核的微部分时,该薄片只是土崩瓦解和高效的准备不再保证。这同样适用于微芯取样。钝尖会造成高压,当冲床被钉进干木材。因此,该形成层层将被压缩。在形成层的细胞( 图5)的结果挤压而不能进行分析。
圆盘取样的确是在分析增长的变化将它们与环境变化的最佳策略。不幸的是这是根本不可能采取从光盘拟取样作进一步分析所有的树。然而,特别是在壳体热带树木年轮的,需要在与增量芯组合一定量的干盘。磁盘被用作基础以限定环的界限,为此,以支持boundarIES定义了基于分析的增量核心12,27,28。
打磨与切割的优点和缺点都经常讨论1,11,21。因为它是上面提到的,最好的程序总是取决于所研究的问题和参数进行分析(宏观或微观)。如果同位素或化学分析被投影在一个进一步的加工步骤,这是最重要的是通过砂磨可填入细胞管腔在整个样品中创建的磨料尘埃,小心地抽真空或压力空气除去。
切削微切片是所有微观分析制备样品用于进一步分析的最适当的方式。首先,该部分被切断的样本,然后可以被保持而没有任何污染的潜在进一步分析。其次,这些路段允许单晶胞参数高分辨率测量。此外,避免了耗时的嵌入技术通过使用玉米淀粉溶液26稳定细胞是在微切 片的一大优势。
微切片的缺点仍然是导致长的制备时间有限的样本大小。对于真正的时间序列分析时光倒流了几百年甚至上千年,有必要进一步发展现有的切割装置17,19,也图像处理和分析18。第一步到这个方向是核心切片机21的发展,最初制造成削减芯平面的表面( 图1)。最近的试验表明,以削减使用这种装置( 图1)整个芯的微切片的能力。
高品质的微型部分提供了基本原则的有效图像分析。服用显微镜下的图像是一种常见的程序19中 ,但它们的有效的分析仍然需要一个任务得到进一步的发展17。所有现有的图像分析系统是半自动,也就是说 ,它们需要更多或更少的强烈的技术人员来控制。在许多情况下,该图像需要被纠正或甚至新的图像必须完成,以提高对比度更好的登记的结构由软件无图像内改变细胞壁的厚度。
专门的图像分析工具,如ROXAS 18 WinCell或ImageJ的29特定脚本能够提供基本解剖学数据,诸如细胞数目,细胞尺寸,细胞壁厚与年轮内细胞的位置。许多额外的解剖度量是相关于一个dendroecological上下文可以从这些基本的测量被计算,如最大导管的尺寸,导管的尺寸分布,早材或导管中的第一行的大小,(光)密度木材,帧内年度导管的大小和细胞壁的剖面厚度,和导管(孤,倍数等 )的分组模式。
使用软件ROXAS 18,导管管腔( 即 ,水导细胞)和年轮边框的轮廓被自动识别和视觉表示为叠加在原始图像。检测算法对于导管是基于颜色,大小和形状的信息,检测算法对每个导管的局部上下文环边界。工具箱使我们能够通过直接编辑叠加功能, 即 ,删除,添加和修改环边界和管道概述手动改善这些结果。编辑之后,最终的数据输出,包括细胞壁厚度(针叶树),自动生成并保存到电子表格。完全自动化的系统目前无法使用,甚至没有对于针叶树示出一个比较简单的结构,但是这是为将来的发展的一个目标。这将有力地支持了福木材解剖参数在时间序列LL整合分析。
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to acknowledge the effort of Sandro Lucchinetti (Schenkung Dapples, Zürich) for constructing the devices needed to guarantee progress in sample preparation.
Increment corer | http://www.haglofinc.com/index.php?option=com_content&view=article &id=57&Itemid=88&lang=en |
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Core-Microtome | http://www.wsl.ch/dendro/products/microtomes/index_EN | ||
Laboratory microtome | http://www.wsl.ch/dendro/products/microtomes/index_EN | ||
Trephor micro corer | http://intra.tesaf.unipd.it/Sanvito/trephorEn.asp | ||
Nawashin solution | Ten parts 1% chromic acid, four parts 4% formaldehyde and one part acetic acid | ||
Picric-Anilin blue | One part saturated aniline blue and four parts Trinitrophenol dissolved in 95% ethanol | ||
Safranin | Empirical Formula (Hill Notation) C20H19ClN4 | ||
Astra-blue | Empirical Formula (Hill Notation) C47H52CuN14O6S3 | ||
Ethanol | Linear Formula CH3CH2OH | ||
Xylol (Xylene) | Linear Formula C6H4(CH3)2 | ||
Canada Balsam | Embedding solution for microscopy | ||
Roxas Software | http://www.wsl.ch/dienstleistungen/produkte/software/roxas/index_EN | ||
ImageJ Software | http://imagej.nih.gov/ij/ | ||
WinCell | http://imagej.nih.gov/ij/ |