Fourier Transform Infrared (FT-IR) spectroscopic imaging is a fast and label-free approach to obtain biochemical data sets of cells and tissues. Here, we demonstrate how to obtain high-definition FT-IR images of tissue sections towards improving disease diagnosis.
고화질 퓨리에 변환 적외선 (FT-IR) 분광 이미징 생화학 적 정보를 연관 상세한 이미지를 얻기 위해 새로운 접근 방식 변환. 조직의 FT-IR 촬상은 중 적외선의 상이한 영역이어서 존재 및 조성물에 관련 될 수있다 (예를 들면, C = O, CH, NH) 세포 또는 조직 내의 다른 화학적 결합에 의해 흡수되는 원리에 기초 생체 분자 (예를 들어, 지질, DNA, 글리코겐, 단백질, 콜라겐). FT-IR 이미지에서, 이미지 내의 모든 픽셀은 세포 유형 또는 질병 유형 분류를 위해 이용 될 수있다 세포의 생화학 적 상태에 대한 정보를 제공 할 수있는 전체 적외선 (IR) 스펙트럼을 포함한다. 본 논문에서는, 우리가 보여 FT-IR 시스템을 사용하여 인체 조직에서 IR 이미지를 얻는 방법, 고화질 이미징 기능을 허용하는 방법과 FT-IR 이미지를 시각화하는 기존 장비를 수정하는 방법에 대해 설명합니다. 우리는 FT-IR의 일부 응용 프로그램을 제시병리학 예로서 간과 신장을 사용. FT-IR 촬상 질병 과정의 일부로서 새로운 생체 분자의 변화에 대한 통찰력을 제공쪽으로 완전히 라벨없는 비 섭동 경로에서 세포 및 조직으로부터 생화학 적 정보를 획득하기 위해 신규 한 경로를 제공하는 흥미로운 애플리케이션을 보유하고있다. 또한,이 정보는 잠재적 생화학 질병 진단의 특정 양태의 목적은 자동화 된 분석을 허용 할 수있다.
IR 분광법은 1930 년대 이후 어떤 형태로 사용할 수있는 분석 도구를하고있다; 그러나, 단지 FT-IR과 조직의 촬상 영역이 분해되었음을 지난 십년 내에되어있다. 때문에 큰 초점면 배열의 가용성 (FPA) 일반적으로 IR 민감한 감지기 1의 수천 탐지기에 데이터 수집의 1) 증가 속도 : 조직 이미징을위한 FT-IR의 발전은 세 가지 주요 개발에 의해 많은 부분에서 구동되었습니다 고급 처리 알고리즘 및 대형 하이퍼 스펙트 럴 데이터를 처리하는 연산 능력의 2, 2) 개발은 3으로 설정되고, FT-IR 촬상 시스템 3) 모델링은 공간 해상도를 극대화하기 위해 4,5-. 조직에서 17 점 스펙트럼 또는지도를받을 수있는 단계를 자세히 자연 프로토콜 용지 외에 다수의 높은 품질과 최근 6-16 FT-IR 분광법의 분야를 검토 매우 광범위한 기사가 있었다. 본 논문에서 우리는 제자에 초점을 맞출 것이다ocol 고화질 기능 변성 FT-IR 시스템에서 128 X 128 FPA 검출기를 이용하여 조직의 영상을 얻었다.
FT-IR 촬상 긴 의한 화소마다 생화학 풍부한 정보를 갖고있는 이미지를 획득 할 수있는 능력에 세포 및 조직 이미징 도구 잠재적 바람직한 것으로 제안되어왔다. FT-IR 촬상은 샘플의 다른 생체 분자가 정량적 중 적외선의 상이한 영역을 흡수된다는 원리를 기반으로한다; 이 '생화학 지문'의 유도 수 있습니다. 이 지문은 서로 다른 세포 유형 및 질환 상태 사이에서 변경하기 위해 많은 연구에 도시되었다. 얼룩 및 면역 마커 시각화하고 진단 및 치료 방법을 안내하는 데 사용되는 종류의 세포 및 조직 구조를 식별하기 위해 사용될 필요가 종래 병리 실제로는 달리, FT-IR에서 이미지는 조직의 본질적인 생화학에 기초하여 형성된다. 현재 techniq진단 염색 조직 UE는 시간 소모적 힘들고, 파괴, 및 FT-IR이 프로세스는, 급속 비파괴, 고도로 자동화 된,보다 객관적인 만들 가능성을 제공하는 반면, 병리학 주관적 전문 지식을 필요로한다. 또한, FT-IR은 기존의 염색 기술을 사용하여 쉽게 액세스 할 수 없습니다 추가 생화학 적 정보를 획득하는 새로운 경로를 제공합니다.
최근 가장 흥미로운 발전 중 하나는 현재 세포 유형 및 광범위한 질병 진단에 중요한 조직 구조의 시각화 및 특성화 할 수 있도록 고해상도 영상화 방법의 가용성이었다. 이러한 기술 중 하나는 많은 연구가 매우 흥미로운 19-25 그 응용을 보여주는, 고해상도 영상 (18)을 허용하는 고 굴절율의 고체 침지 렌즈 (SIL)을 갖추고있어 약독 총 반사율 (ATR) FT-IR이다. 또한, w최근 인 ATR 촬상과 연관된 증가 된 공간 해상도는 내피 유방암 진단 (26)의 주요 구성 요소를 형성 유방 조직의 근 상피 세포의 시각화 및 분류를 위해 허용 할 수 있음을 입증 하였다. ATR 촬상 매우 유용하지만,이 기술은 FT-IR 이미지를 형성하기 위해 조직과 접촉하도록 SIL을 요구; 따라서, 그것의 사용은 어느 정도 조직의 큰 영역이 빠르게 군데해야 조직 병리에 대한 제한됩니다.
두 번째 방법은 IR의 밝은 소스로 싱크로트론을 사용하는 기존 FT-IR 시스템에 고배율 대물 결합에 의해 증명되었으며, 그것은 완전히 0.54 X 0.54 ㎛, 유효 화소 크기 FPA 화상을 조명 할 수있다. 우리가 기존의 FT-IR 시스템 (4)를 사용하여 분해되지 않은 유방암과 전립선 조직의 주요 구조를 시각화하는이있었습니다. IR 이미지 공간 resolutio 이러한 극적인 증가하는 동안n은 그것의 사용으로 인해 싱크로트론을 필요로 제한 남아, 흥분했다. 이어서, 최적의 시스템은 고화질 촬상 싱크로트론 광원의 요구없이 1.1 X 1.1 ㎛의 화소 크기를 갖는 기능 아니라 전통적인 globar의 IR 소스 (5)를 사용하기 위해 허용 할 수 있도록 설계되었다. 이 글에서, 우리는 여러 IR 목표 (15 배, 36 배, 그리고 74X)를 사용하여 노이즈 비율 허용 신호와 조직의 회절 제한 IR 이미징이 가능하도록 기존의 상업 FT-IR 이미징 시스템을 수정하는 방법을 보여줍니다. 세 가지 목표와 유효 화소 크기는 5.5 X 5.5 μm의 (15 배), 2.2 X 2.2 μm의 (36 배) 및 1.1 X 1.1 μm의 (74X). 우리는 간과 신장 조직 검사 (27)에 질병 검출을위한 공간 해상도의 이익의 중요성의 몇 가지 예를 제공합니다.
FT-IR은 병리 진단의 현재 표준을 개선하는데 중요한 역할을 할 수있는 가능성, 조직 절편의 라벨없는 생화학 이미징을위한 신흥 양상이다. 병리에 대한 현재 황금 표준은 조직이, 파라핀, 포르말린에 고정, 생검을 여러 번 절단, 여러 얼룩으로 염색하는 것이 필요합니다. 고도로 훈련 병리학 주관적 시각적 진단을 판별 조직 구조 및 세포 형태를 평가한다. 여기서 우리는 섹션들의 동일한 유형으로부터 고해상도 IR 이미지를 수집하고 세포 유형 및 질환 상태 사이의 화학적 차이를 조사하기 위해 어떤 계산 방법을 설명하는 방법을 보여준다.
이 프로토콜 내에서 중요한 단계는 조직은 매우 신중하게 집중되도록하고 있음은 물론 시스템은 매우 높은 품질의 분광 데이터를 보장하기 위해 교정된다. 시스템 설정 관리는 특히 criti입니다 CAL은 고배율 목표로 작업 할 때. 문제 해결을 돕기 위해, 다음은 발생 가능한 문제 중 일부는 커버;
문제 : 반영 이미징 낮은 IR 강도. 해결 방법 : 반사 코팅 슬라이드의 반대쪽에있을 수 있으므로 IR 슬라이드 방향을 확인합니다.
문제 : 랜서 컨트롤의 낮은 신호 / 적색 경고 기호입니다. 해결 방법 : LN2와 함께 멋진 탐지기. 액체 질소가 작동 할 수있는 FPA 탐지기 필요하며 주기적으로 얹어되고 필요합니다.
문제 : 속도 오류 / 이동 오류. 해결 방법 : 분광계를 재설정하고 진동을 줄일 수 있습니다. 진동은 간섭계의 이동 미러 방해하게됩니다.
문제 : 데이터의 수증기 스파이크. 해결 방법 : 시스템에 퍼지을 높이고 공기 샘플을 보호합니다.
문제 : 잘못된 centerburst. 해결 방법 : 다시 centerburst 찾기.
e_content "> 문제 :. 전송에 낮은 플럭스 차이, 집중에도 불구하고 해결 방법 :. 적외선 빛이 시료의 한 지점에 집중되지 않는로 바닥 콘덴서 조정이 발생합니다.본 논문은 전송 또는 transflectance의 모드에서 조직의 고화질 적외선 이미지를 수집하는 방법에 초점을 맞추고있다. FT-IR 촬상의 특성상, 이러한 기판의 종류, 고정술, 샘플 두께 스펙트럼 해상도, 간섭계 거울 속도 등 이들 파라미터의 영향 등 데이터 수집에 제조 될 수있는 다수의 변형들이 존재한다는 것이다 갖는다 최근 4,5,17,51 광범위한 자세히 설명되어.
ATR 모드 10,24,26 이미징 포함하고 고해상도 IR 촬상을 허용하도록 나노 스케일 열 (52, 53) 접근법을 사용하여 촬상 시스템으로 이루어질 수 변형들이있다. 고해상도 IR 영상의 가장 큰 한계는 TI 것입니다ssues은 (일반적으로 4 μm의 두께)를 통과하기 위해 조심스럽게 준비하고 IR 충분히 얇은해야합니다. 또한, 전송 및 반사율 FT-IR 영상 인해 물에 의해 IR의 흡광도를 건조하기 위해 샘플을 필요로한다. 그러나, FT-IR 영상이 점에서, 다른 기술에 비해 상당한 장점을 가지고 그것을 할 수있는 조직의 매우 빠른 속도로 이미지 넓은 지역에 풍부하고 상세한 생화학 적 정보를 도출한다. 라벨이없는 방식으로 생화학 적 정보를 도출 기타 유사한 기술은 라만 분광법 그러나 데이터 수집의 시간은 이미지를 수집하는 것이 훨씬 느리다을 포함한다. 라만 새로운 촬상 방식 자극 된 라만 산란 (SRS)과 일관된 Antistokes 라만 산란 (CARS)을 포함하여 등장하고; 그러나 이러한 접근 제한 스펙트럼 범위 또는 단일 주파수 촬상있다.
데이터 수집, 공간 해상도 및 계산 방법의 가용성의 속도 발전은 FT-IR의 IMAG을 만드는 엄청난 가치왔다병리의 새로운 이미징 도구로 번역에 대한 더 실현 가능한 방법을 보내고. 공간 해상도의 최근 발전으로 인해, 종래의 FT-IR 촬상 시스템을 사용하여 분해없는 키 세포 유형에 조직 병리에 특히 중요왔다. 레디 등의 알에 의해 최근 종이. FT-IR 촬상 시스템 (5)의 최적 공간 해상도를 얻기위한 이상적인 시스템을 모델링하는 방법을 설명했다. 본 논문에서 제시 한 신장 조직의 예는 사구체 구조 (그림 3과 그림 5)에서 생화학 적 정보를 추출하기 위해 높은 공간 해상도의 중요성을 보여줍니다. 향후, 양자 폭포 레이저와 같은 매우 밝은 IR 광원의 새로운 발전은 54-57, 3D 분광 영상 (58), 및 나노 IR 기술 분야의 혁신은 52,53,59,60가있을 수 있습니다 연구의 흥미로운 새로운 길을 잡아 조직 이미징의 미래에 큰 영향.
<p cl진단 값이 될 수있는 부가적인 생화학 적 정보는 필요가 여기서 엉덩이 = "jove_content"> 우리는 간, 신장 질환에 응용 프로그램의 예를 제시 하였다. 시카고 일리노이 대학 병리학 교실의 스펙트럼 병리학 연구소는 질병 진단의 개선으로 IR 이미징 기술의 번역에 초점을 맞추고 환자 결과의 예측을 향상시킬 수있다. FT-IR 영상은 양적 객관적인 정보가 필요 병리 연습에서 현재 몇 가지 한계를 극복 할 수 있습니다. 특히, 미래의 작업은 현재의 기술은 적절한 진단 감도를 제공하거나 제한된 정보를 제공하지 못한다 전류 병리 실제로 영역을 식별에 집중된다. 분명 필요 병리의 현재의 관행을 개선하고 고화질 FT-IR 영상을 사용하여 달성 될 수있는 환자의 질병 상태에 대한 병리학 자, 더 많은 정보를 제공으로 존재한다.The authors have nothing to disclose.
We would like to acknowledge the Department of Pathology at the University of Illinois at Chicago for financial support. Histology and visible imaging services were provided by the Research Resources Center – Research Histology and Tissue Imaging Core at the University of Illinois at Chicago established with the support of the Vice Chancellor of Research, in particular we would like to thank Ryan Deaton and Andy Hall for their expertise. We would also like to thank Agilent Technologies, in particular Frank Weston for support and loaning of additional IR lens.
Cary 600 Series FT-IR system | Agilent | Multiple configurations | Alternate FT-IR imaging systems exist |
Adjustable ReflX Objective 74X/0.65NA IR | Edmund Optics | 66-592 | |
Adjustable ReflX Objective 36X/0.5NA IR | Edmund Optics | 66-586 | |
MirrIR slide | Kevley Technologies | CFR | For FT-IR reflection-mode measurements |
Barium Fluoride slides | International Crystal Laboratories | Multiple sizes | For FT-IR transmission-mode measurements |
Calcium Fluoride slides | International Crystal Laboratories | Multiple sizes | For FT-IR transmission-mode measurements |
Dry Nitrogen/Dry Air gas | Multiple gas suppliers | Multiple sizes | |
Hexane | Sigma Aldrich | Multiple sizes | For deparafinizing tissue |
Liquid Nitrogen | Multiple cryogenic liquid suppliers | Multiple sizes | |
ENVI-IDL software | Exelis-Vis | Other software packages available | |
Whole slide Imager | Scanscope (Aperio) or Nanozoomer (Hamamatsu) | To image stained slides |