This protocol describes the measurement of isometric contraction in an isolated smooth muscle preparation, using an isolated tissue bath system and computer-based data acquisition.
Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues. While this technique has been implemented for over 100 years, the versatility, simplicity and reproducibility of this assay helps it to remain an indispensable tool for pharmacologists and physiologists alike. Tissue bath systems are available in a wide array of shapes and sizes, allowing a scientist to evaluate samples as small as murine mesenteric arteries and as large as porcine ileum – if not larger. Central to the isolated tissue bath assay is the ability to measure concentration-dependent changes to isometric contraction, and how the efficacy and potency of contractile agonists can be manipulated by increasing concentrations of antagonists or inhibitors. Even though the general principles remain relatively similar, recent technological advances allow even more versatility to the tissue bath assay by incorporating computer-based data recording and analysis software. This video will demonstrate the function of the isolated tissue bath to measure the isometric contraction of an isolated smooth muscle (in this case rat thoracic aorta rings), and share the types of knowledge that can be created with this technique. Included are detailed descriptions of aortic tissue dissection and preparation, placement of aortic rings in the tissue bath and proper tissue equilibration prior to experimentation, tests of tissue viability, experimental design and implementation, and data quantitation. Aorta will be connected to isometric force transducers, the data from which will be captured using a commercially available analog-to-digital converter and bridge amplifier specifically designed for use in these experiments. The accompanying software to this system will be used to visualize the experiment and analyze captured data.
약리학 분야는 150 년 이상 격리 된 조직 목욕 시스템을 사용하고있다. 이 시스템의 범용성은 고혈압, 심장 부전, 당뇨병, 위장 질환, 방광 질환 또는 장애를 가진 수백만 명의 개인을 치료 한 요법의 기초를 형성하는 이러한 지식으로, 수용체 및 수용체 신호 전달을 특성화하기 위해 전세계 과학자 허용했다 장애, 천식, 연하 장애, 몇 가지 이름. 이 조직은 조직의 기능을 할 수 있습니다로이 날을 위해, 고립 된 조직 목욕, 신약 개발 및 기초 연구의 중요한면을 남아있다. 이 주피터 과정에서는 공식적인 프로토콜은 수용체의 특성을 허용 아이소 메트릭 수축을 측정하는 격리 된 조직 목욕 실험의 데이터를 이용하여 시각 및 가상 실험을 설명하기 위해 공유됩니다.
이 기술의 주요 장점은 조직 생활된다는 것이다몸에 관련된 생리 학적 결과 (수축 또는 이완)와 전체 조직으로 차 기능. 이 단계 (약물 – 수용체 상호 작용, 신호 전달, 두 번째 메신저 세대, 평활근의 흥분의 변화, 조직 기능의 변화)의 합성이다. 다른 기술은 이러한 각 단계의 연구 (예, 방사성 리간드 약물 친 화성, 두 번째 메신저의 측정에 대해 구속력을) 할 수 있지만, 분리 된 조직 조 기술은 이러한 모든 단계를 하나의 통합 할 수 있습니다. 또 다른 장점은 조직의 기능을 유지하는 셀룰러 설정 대 조직에 더 의미가있는 중요한 약물 학적 변수의 계산을 허용한다는 것입니다; 이 조사 된 약물이 전체 몸에서 어떻게 작동하는지에 가까운 온다.
연구 도구로 아이소 메트릭 힘의 측정은 150 세 이상이지만, 수축 조직 2 수용체의 특성에 대한 프로토 타입 기술되고 있습니다. 이 기술의 힘은 단순함과 다양성에있다 : 길항제의 존재 또는 부재 하에서 작용 물질의 농도를 증가시킴으로써 유도 반응을 기록함으로써, 정보의 무수한 각 약물의 약리학 적 특성 및 수용체에 대해 유도 될 수있는 그것은 3-5을 결합한다. 이러한 유형의 실험이 또한 사용될 길항제 비경쟁 자연 대 경쟁에 대한 정보뿐만 아니라, 수용체 얼룩이 비특이적 약효 6-8 가너. 따라서,이 절연 조직 조 간단한 실험으로 치환 작용제 – 유도 된 근육 수축을 매개하는 수용체의 약리학 비교적 완전한 프로파일을 생성 할 수있다.
효능 작용의 측면에서, 제해당 조직에서 작용제의 전자 상대 효능 (E MAX)과 힘 (EC 50) 같은 조직 한 다른 작용제의 응답에 비해 계산 될 수있다. 우리의 실험에서는, 래트 흉부 대동맥 비히클 또는 종래 수축을 조직 조에 α 1 아드레날린 작용제 페닐에 첨가하고 생성 한 시간 동안 α 1 아드레날린 수용체 길항제 프라 조신 (5 ㎚) 중 하나와 함께 배양 하였다. 수정 된 결과를 두 선물 도표 녹색 응답이 최대로 표시 PE에 의해 달성의 최대 수축으로 표시 한 그림 1의., ½ 최대 수축하게 표시하고 응답하는 것이 원인이 된 PE 농도와 관련. 이러한 값을 식별하는 것은 반 최대 (50 %) 반응 또는 EC (50) 값을 달성 작용제의 유효 농도를 식별한다.
불행하게도, 작용제에 의존하는 매개 변수를 사용하여수용체 결합 특성이 9 복잡 할 수 있습니다 결정하기 위해 혼자에요. 상수 길항제 해리 PK (B)의 -log 10 몰 길항제 -log 10 : 이상적으로, 수용체 길항제를 사용하여 추가 실험은 약물과 수용체 사이의 상호 작용을 정의하는 중요한 두 가지 중요한 파라미터들의 계산을 허용 필요한 농도의 농도 – 반응 곡선에서 두 배의 우측 시프트 (PA (2)) (10)을 유도한다. K 및 PA B 2 이득들이 작용제 독립적 값이며, 심지어 다른 조직 (11) 사이에 일정하게 유지된다는 사실로부터 유용성 양쪽 모두. 다른 계산 된 값 (50)을도 2의 데이터로부터 약동학 B는 다음 방정식을 이용하여 계산 될 수 있고, EC에 기초 :
= 2 × 10-8 M 프라 조신의 부재하에 50 EC
사전에 EC (50)프라 조신의가 나타나지 않는 = 7 × 10 -6 M
다음의 수학 식 B에 K를 풀 :
로그인 (DR-1) = [B] 로그 – K B 로그
장소 :
[B]는 길항제 농도 = 5 X 10-9 M. 로그인 (5 × 10-9 M) = -8.3
박사 = 없을 길항제 / EC (50)의 존재 EC 50 값의 용량 비율. 우측 시프트가있는 경우,이 값은 1보다 클 것이다. 따라서 :
박사 = 7 × 10 -6 M / 2 × 10 -8 M 700 × 10 -8 M / 2 × 10 -8 M = 2분의 700 = 350
[B]와 박사를 대체 :
K B를 기록 – = -8 (350-1)를 기록
2.54 = -8 – KB 로그
의 pKa B = 10.54
프라 조신은 α 1 아드레날린 RECEPT와 상호 작용할 때 프라 조신이 값은 얻은 값과 일치페닐에 프린에 수축을 매개 아드레날린 수용체 α 1 아드레날린 수용체임을 제안 또는 12,13.
몇 가지 단계는이 실험의 성공에 매우 중요합니다. 조직은 조직의 생존력 상실을 방지하기 위해 박리 후 남아 있어야 PSS. 모든 아이소 메트릭 근육 준비 수동 장력 (14, 15)에 대해 최대한의 힘을 생성하는 최적의 길이 긴장 관계를 가지고있다. 이 프로토콜에서 설명하는 실험에서, 최적의 수동 장력 티슈는 이전에 수동 장력 0.5 g의 잠깐 씩 첨가하여 결정 하였다. 조직 톤없이 시작해야하고 평형의 30 분 후, 조직 활성 톤 생성의 KCl (80 mM)을 최대의 농도로 도전되었다. 이어서, 조직을 세척하고, 기준 계조로 복귀시켰다. 기준선에서 15 분 후, 수동 장력의 또 다른 0.5 g을 넣고,이 프로세스의 고원까지 반복활성 장력을 추가 수동 긴장을 달성했다. 예비 실험에서, 수동 장력 4g 총량 대동맥에서 최대 활성 장력 발생을 달성하도록 결정하고, 따라서 장력의 총량이 이전에 평형화 고리 상에 배치된다. 절차 적으로, 이는 종래 수동 장력 애플리케이션을 제로로 최선이지만, 실험 전에 언제든 수행 될 수있다. 실험 또는 해부 어느 시점에서, 조직을 스트레칭 오버, 부정적인 조직의 생존과 실험 결과에 영향을 미칠 것입니다. 이 단계는 과량 신축성 높은 가능성을 갖는 한, 조직 욕에 배치 할 때 가장 필수적이다. 수와 기간에 적절한 세정, 재현 효과를 위해 필요합니다. 두 번째 문제는 너무 빨리 조직이 기준 긴장 돌아왔다 초기 접종 후, 또는 그 이전에, 비정상적인 반응 발생합니다. 가역 길항제 / 저해제를 공부하는 경우, 조직은 inhibi로, 추가 작용제하기 전에 세척하지 마십시오토르 농도는 감소 될 것이다.
분리 된 조직 목욕 분석에 주목할만한 장점과 단점이 있습니다.
단점 : 조직은 후크 고리의 제거 수술 또는 배치하는 동안 손상의 다른 정도가 발생할 수 있습니다. 내피 세포의 환상 대동맥의 내벽이 때문에 전지 층을 손상시키지 않도록주의가 후크 고리의 위치에주의해야한다. 조직들은 또한 조직 조에서 생존하는 시간의 뚜렷하게 상이한 길이를 가질 수 있고,이 결정되어야한다; 모든 조직은 동일하다. 이와 더불어, 조직은 시간이 컨트롤은 모든 실험 필요한 제어가되도록 하루 종일 자신의 응답에서 변경 될 수 있습니다. 이것의 좋은 예는 전형적인 8 시간의 실험 기간 동안 100 %에 의해 수축력 최대로 향상 기니피그 기관이다. 물에 난 용성이다 마약 PSS에 침전 수 있습니다. 마지막으로, 누적차 효능에 대한 수용체의 탈감작이 발생하는 경우 작용제는 다른 결과를 초래할 수있는 약물의 비 누적 추가; 안지오텐신 II는 빠른 과내를 보여줍니다 하나의 약물이다.
장점 : 조직 조 실험의 주요 이점 중 하나는 실시간이라는 것이다; 그것은 전개하고 신속하게 결론을 확인하고 실험 기간 동안 다음 단계뿐만 아니라 문제 해결을 계획 할 수 있습니다으로 한 실험을 볼 수 있습니다. 실험은 할 수있는 일이 걸립니다. 여러 조직은 통상적 동물 자체 조절 역할을 할 수 있도록 하나의 동물에서 제조 될 수 있으며, 그 강도를 실험에 추가한다. 약물 조직의 비교적 순수한 응답을 테스트하도록 하나는 다른 요소로부터 조직을 분리 할 수있다. 그러한 조직 조 시스템과 같은 시험 관내 실험은 생체 내 실험과 비교하여 약물의 적은 양의 사용을 허용한다.
본원에 기재된 염기성 실험 설계가 될 수광범위하게 추가 매개 변수의 기록 또는 다른 외부 자극의 도입을 허용하도록 수정했습니다. 예를 들어, 전극의 첨가는 근에 분포하는 신경 16,17의 전기장 자극 허용한다. 열이나 산도 프로브의 추가로, 수축 온도에 응답하여 pH의 영향도 18,19를 측정 할 수있다. 이와 유사하게, 산소는 부분적으로 또는 저산소증 유도 효과를 평가하기 위해 N이 전체에서 대체 할 수 있습니다. 또한,이 비디오에 사용 된 아이소 수축력 측정의 기본 원칙은 동일한 세포 내 칼슘 20 등척성 장력 개발 및 변경을 허용 수반 측정 시스템을 개발하는데 사용될 수있다. 그 시스템은 빠르게 반응 동안 조직 샘플을 고정 할 수있는 신호 변환 이후도 용이하게 검토되고, 신호 전달 경로 시스템의 생화학 적 활성을 검증 할 수 있도록.
EQU의 변화이 작업을 수행하는 데 사용할 수 있습니다 ipment은 거대하다. 이 모든 시스템 구성 또는 자동 양손은 여러 다른 회사에서 구입하실 수 있습니다. 이 프로토콜에 사용되는 조직 화장실 조직 홀더는 사내 미시간 주립 대학 기계 상점에 의해 손으로 날려 (조직 화장실)과 손 건설 (홀더)이었다.
The authors have nothing to disclose.
The Watts Laboratory through the years, and Dr. Marlene Cohen and Kathy Schenck for teaching us this assay over two decades ago. NIGMS R25GM074119 supported development of this teaching module for a Short Course in Integrative and Systems Pharmacology held on the campus of MSU from 2005 to 2013.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
LabChart Software | ADInstruments | 7.2 | |
PowerLab (4 channel) | ADInstruments | ML760 | |
QuadBridge (4 channel) | ADInstruments | ML112 | ML112 |
Grass Adapter Cable | ADInstruments | MLAC11 | MLAC11 |
Grass Force-Displacement Transducer | Grass Instrument Co | FT03 | FT03 |
Grass Transducer Cable | Grass Instrument Co | TAC-7 REV-1 | |
BNC to BNC Cable | ADInstruments | MLAC01 | |
IsoTemp 2100 | Fisher Scientific | IC-2100 | |
Tissue Bath | Multiple Sources | ||
Physiological Salt Solution | PSS | ||
Braided Silk Suture | Harvard Apparatus | 51-7615 | SP104 |
Ring Stand | Humboldt MFG Co | H-2122 7 | |
Dissecting Dishes | Handmade with Silicone | ||
Tygon Tubing | VWR Scientific | 63010-100 | R-3603 |
Hose Clamps | Cole-Parmer Instrument Co | 06832-08 | SNP-8 |
50ml Muscle Bath | Eberhartglass Blowing | Custom | |
250ml Warming Chambers | Eberhartglass Blowing | Custom | |
Gas Dispersion Tube | Ace Glass | 7202-06 | 7202-02 |
Micrometer | |||
Custom Stands | |||
Three-Prong Clamps | VWR International | Talon | |
S-Connector | VWR International | Talon | |
Tissue Hooks | Hand Made in House | Custom | |
Tissue Dissection | |||
Leica Stereomicroscope MZ6 | Leica | 10447254 | |
Stereomaster Microscope Fiber-Optic Light Source | Fisher Scientific | 12562-36 | 12562-36 |
Culture Petri Dish | Pyrex | 7740 Glass | |
Sylgard Silicone Elastomer | Dow Corning | Sylgard 170 Kit | |
Vannas Scissors | George Tiemann & Co | 160-150 | 160-150 |
Splinter & Fixation Forceps | George Tiemann & Co | 160-55 | 160-55 |