Ex-Vivo Lung Perfusion (EVLP) ha permesso il trapianto di polmone nell'uomo a diventare più facilmente disponibili, consentendo la possibilità di valutare gli organi ed espandere il pool di donatori. Qui, descriviamo lo sviluppo di un programma di topo EVLP e filtri che consentono un modello riproducibile per espansioni future.
Il numero di polmoni donatori accettabili disponibili per il trapianto polmonare è molto limitata a causa della scarsa qualità. Ex-Vivo Lung Perfusion (EVLP) ha permesso il trapianto di polmone nell'uomo a diventare più facilmente disponibili, consentendo la possibilità di valutare gli organi ed espandere il pool di donatori. Poiché questa tecnologia si espande e migliora, la capacità di valutare potenzialmente e migliorare la qualità dei polmoni scadente prima del trapianto è una necessità critica. Per valutare più rigorosamente questi approcci, un modello animale riproducibile occorre stabilire che permetterebbe sperimentazione di tecniche migliorate e gestione dei polmoni donati nonché al destinatario polmone-trapianto. Inoltre, un modello animale EVLP di patologie associate, ad esempio, la ventilazione indotta danno polmonare (VILI), fornirebbe un nuovo metodo per valutare trattamenti per queste patologie. Qui, descriviamo lo sviluppo di un programma di polmone EVLP ratto e filtri di questo meThOD che consente un modello riproducibile per espansioni future. Descriviamo anche l'applicazione di questo sistema EVLP modellare VILI nei polmoni di ratto. L'obiettivo è quello di fornire alla comunità di ricerca con informazioni chiave e le "perle di saggezza" / tecniche emerse dalle prove ed errori e sono fondamentali per stabilire un sistema EVLP che è robusto e riproducibile.
Rilevanza clinica
Attualmente vi è una scarsità di polmoni idonei disponibili per il trapianto di solo il 19% dei polmoni di essere in grado di essere utilizzato a livello nazionale che porta a protratta tempo di attesa-list o pazienti che muoiono in attesa di trapianto 1. La carenza può essere causa di donatori anziani, traumi, infezioni, insufficienza multipla d'organo e polmoni donatori talvolta feriti su raccolto 2. Inoltre, il polmone è un organo fragile di fuori della cavità toracica e tecniche di trasporto e conservazione normali può portare a deterioramento e non vitali polmoni. Pertanto, mantenere e migliorare la redditività del polmone ex-vivo è recentemente diventato un obiettivo importante in medicina trapianto di polmone.
Ex-vivo Lung Perfusion (EVLP)
Ex-vivo perfusione polmonare (EVLP) si è evoluto a perfusione continua organi in corso di valutazione per il trapianto e consente un periodo di valutazione che tuttiOWS per il potenziale di rianimazione polmonare o ricondizionamento. EVLP può prolungare totale di organo del corpo tempo ischemico e consentire agli organi donati per viaggiare distanze maggiori di 3. In genere, i polmoni sono ventilati al 50% della capacità polmonare totale o 20 cmH2O di pressione delle vie aeree picco con una frazione di ossigeno inspirato (FiO2) del 30% al 50% 4. Conservazione soluzione è perfuso in 40-60 ml / kg (circa il 40% della gittata cardiaca previsto di 100 ml / kg) negli esseri umani e animali di grandi dimensioni 5,6, ma è perfuso intorno al 20% della gittata cardiaca per i ratti 7. L'inclusione di soluzione STEEN ha permesso polmoni umani di viaggiare in ambienti RT senza sviluppo di edema polmonare 9. Questo lavoro pionieristico è stata perfezionata dalla University of Toronto Lung Transplant Programma 10-13 ed è in corso di valutazione per una migliore valutazione dei polmoni donatori marginali per il trapianto 14,15. Tuttavia, il ventilatio ottimalen e perfusione condizioni necessarie per rigenerare i polmoni marginali e / o sub-standard, per il trapianto non è noto ed è attualmente una superficie attiva di ricerca.
Isolato sistemi di perfusione polmonare sono stati utilizzati nei piccoli animali per causare danno polmonare, ricreare malattie respiratorie, e profumato polmoni con diverse soluzioni per impedire il danno ischemico. Gli investigatori hanno creato un modello di piccoli animali di trapianto polmonare, utilizzando il sistema isolato polmone-perfusione per imitare i protocolli EVLP che potrebbero essere utilizzati nell'uomo e negli animali più grandi 16-18. Tuttavia, questo modello sperimentale ha molte sfide per quanto riguarda le varie tecniche e parametri utilizzati per imitare fisiologia umana. In particolare, ci sono molte sottigliezze nel mantenere la vitalità del polmone durante EVLP. Queste sottigliezze possono sorgere a causa di differenze nella tecnica di raccolta, le impostazioni di ventilazione a pressione positiva, le condizioni di composizione e del flusso perfusato e incannulamento del polmone. Therrima, l'obiettivo è quello di fornire alla comunità di ricerca, con un numero di risoluzione dei problemi e di implementazione suggerimenti che abbiamo trovato portare ad un metodo affidabile per implementare EVLP in un modello di roditore.
SISTEMA DI MONITORAGGIO
Quali cose simile a quando esperimento sta funzionando bene:
Una volta che le cannule sono state collocate nel circuito ei polmoni sono ventilazione, ci sono diversi modi per garantire che il sistema funzioni correttamente. Non ci dovrebbero essere perdite di perfusato tutta la linea. La resistenza vascolare polmonare (PVR) dovrebbe rimanere relativamente costante (ipotizzando un flusso costante). Lo scambio di ossigeno dovrebbe aumentare una volta che il ventilatore funzioni correttamente e ampliando i polmoni di reclutare più alveoli per lo scambio di gas. Figura 12A mostra polmoni collegati al circuito EVLP all'interno del torace artificiale adeguatamente ventilato e perfuso.
Quali cose simile a quando esperimento non funziona bene:
Ci sono alcuni problemi comuni che hanno avuto il più alto tasso di occorrenza durante le fasi iniziali di un esperimento EVLP. Il primo e più semplice to rimedio è una perdita nella linea di uscita dal polmone. Questo è evidente da un pool di raggruppamento perfusato sotto parte del circuito e il livello nel serbatoio continua diminuzione. Controllare e stringere i connettori dei tubi intorno alla area della perdita e ispezionare il tubo stesso per una perdita. Se questa perdita si verifica prima del polmone, può anche introdurre bolle nel polmone. Questo dovrebbe essere risolto il più rapidamente possibile, come bolle d'aria nel perfusato provocheranno danni ai tessuti e causare un aumento significativo del PVR. Ci può essere anche una perdita proveniente dal polmone o una delle cannule. Ciò può essere causato da uno slittamento di una cannula o un'ostruzione nella linea uscente provocando un accumulo di pressione. Controllare la posizione per entrambe le cannule per garantire né è scivolato o torta. La pressione PA dovrebbe essere monitorata durante questo processo, perché un aumento istantaneo della pressione PA è un segno evidente che di recente si è verificato un ostacolo di qualche tipo. Figura 12Bmostra un polmone rottura che rotto a causa di pressioni elevate. Una perdita dal polmone stesso può anche essere causato da uno strappo nel tessuto. Questo problema può o non può essere riparabile ma riposizionamento e serrando nuovamente il cannule è l'opzione migliore in questo scenario.
Key Learning Punti / opportunità:
Trial e lo sviluppo di errore del sistema di perfusione polmonare ex-vivo hanno permesso di individuare alcuni punti chiave che ci viene qui delineato per facilitare l'efficace attuazione del sistema EVLP. In primo luogo, per quanto riguarda l'approvvigionamento, è importante che le tecniche anestetiche standard sono seguiti per anestetizzare correttamente gli animali (abbastanza anestetici, iniezione nel peritoneo) e adesione a tutte le politiche IACUC è richiesto. Il cannule (mostrato in Figura 13 A, B, e C) dovrebbe essere ripetutamente lavato per rimuovere eventuali coaguli e / o detriti nel vasculat polmonareUre. Per quanto riguarda la selezione degli animali, si consiglia di utilizzare Sprague Dawley o Lewis ratti peso di 250-350 g. Particolare attenzione dovrebbe essere presa quando cannulating ratti di peso vicino ai 250 g, poiché le imbarcazioni saranno più piccola e quindi molto più difficile da cannulare senza ferire la vascolarizzazione. Se ratti più piccole, o un modello di topo, deve essere utilizzato, più piccola cannula può essere necessario utilizzare.
Tracheale cannulazione non è tipicamente impegnativo finché la sutura viene fissato correttamente prima passando una sutura di seta posteriormente alla trachea dopo sezionare i fascia circostanti e prima cannulazione. Seguire questo con un anteriore incisione 1-2 anelli tracheali sopra la sutura di passare la cannula. Tie nodi quadrati tra gli anelli tracheali per fissarlo in una gola per maggiore sicurezza (Figura 4C). Incannulazione dell'arteria polmonare (PA) è più impegnativo rispetto alla cannula tracheale. Le seguenti operazioni sono stati usati in questo studioper questa procedura. In primo luogo, cogliere l'apice del cuore con un paio di pinze. Passare un altro paio di pinze in seno trasverso e filo una sutura per fissare la cannula nel prossimale PA. Incidere subito il ventricolo destro prima che il diritto tratto di efflusso ventricolare (RVOT) (Figura 14A). Dopo l'incisione nella RVOT, la cannula viene guidato verso il tratto dell'arteria polmonare efflusso. Avendo la sutura nella posizione dietro la polmonare / aorta prima della ventricolotomia destra aumenta l'efficienza (Figura 5C). La cannula dovrebbe essere fissato in posizione con la sutura per evitare dislocazione. Una complicazione grave può verificarsi se la cannula PA non è l'orientamento anatomica corretta. La cannula può essere inserito troppo in là e solo defluire in un ramo o diventare mal-posizionata con torsione del campione cuore-polmone dopo l'estrazione dalla cavità toracica. Questo può essere facilmente orientato nella posizione originaria di preservare il corretto angolo di anatomiPosizione cal. Infine, atriale sinistro (LA) incannulazione è la parte più impegnativa della procedura. La cannula LA deve essere posizionato all'interno dell'atrio sinistro. Con i tessuti essere estremamente friabile, fare attenzione a non usare la forza significativa o torsione per evitare una rottura all'interno della vena polmonare e atrio sinistro che sarebbe poi rendere l'esperimento irrecuperabile. La cannula PA è nella posizione migliore prima cannula LA. Un ventricolotomia sinistro con la rimozione dell'apice ha dimostrato di perturbare il tendinee cordae e permettere un più facile accesso attraverso volantini mitrale. Inoltre, il ventricolotomia rende più facile dilatare e visualizzare la valvola mitrale e per alimentare la cannula attraverso la valvola mitrale. Dilatazione dell'annulus della valvola mitrale con una coppia di piccole blunt-ended pick-up può essere realizzata in modo da visualizzare il tratto in LA (Figura 14B). Sutura deve essere posizionato dietro il cuore prima di incannulamento. Questo può essere fatto semplicemente sollevando cuore utilizzando una coppia di gocciolil blunt-ended pick-up e mettendo la sutura sotto e attraverso il cuore. La LA è ora pronto per essere cannulata. Feed cannula LA attraverso pick-up per visualizzare correttamente il posizionamento della cannula nell'atrio sinistro. Faccia attenzione a non rimuovere la cannula di nuovo nel ventricolo sinistro. La sutura deve poi essere saldamente fissato lungo il miocardio del ventricolo sinistro. Assicurare la sutura all'atrio sinistro potrebbe occludere l'intera o parte della cannula.
Durante la procedura, è fondamentale che l'aria rimanga nella sezione afflusso di dell'apparecchiatura. L'aria significativa può produrre un'embolia aria aumentare la PVR (efficacemente un "air-lock") che si tradurrà in un flusso perfusato molto inferiore per una data pressione. Vari punti possono essere utilizzati per rimuovere l'aria all'interno del sistema. Aria all'interno della sezione di efflusso è previsto e non dovrebbe avere alcun effetto deleterio sulle polmoni. Un modello suino di ipertensione polmonare è statadimostrato di ricreare la patologia da continue piccole quantità di aria oltre un periodo di 8 settimane. L'aria aumentato diminuisce la quantità di perfusione presente mentre causando infiammazione ai tessuti circostanti 19.
L'apertura di perfusione può verificarsi quando la cannulazione è completa, ma prima che il tubo proveniente dalla LA è collegato alla linea EVLP. Perfusato deve essere eseguito tramite per cancellare eventuali coaguli di sangue e questo può svuotare perfusato nella parete toracica senza problemi. Inserimento della pompa perfusato in modalità manuale e aumentando lentamente la portata di ~ 2 ml / min consente un attento monitoraggio della pressione PA. Pressioni oltre 20-30 cmH2O possono indicare un ostacolo e guardare per uscire dal perfusato LA è anche un indicatore, ma questo può essere molto difficile da vedere. Se la pressione non aumenta di oltre 20-30 cmH2O, arrestare la pompa e ricontrollare entrambi cannulazioni. Una volta che la pressione è costante intorno 10-20 cmH2O consentire the perfusato a correre attraverso e nella cavità toracica per 2 min. In questo momento la linea dal LA può essere collegato al circuito EVLP. La velocità della pompa perfusato può essere aumentata a 5-10 ml / min. Come la testa fluida progredisce attraverso il circuito, ci sarà un aumento della pressione PA dovuto all'aumento in altezza della testa fluida e quindi la pressione statica. Se il fluido non può fluire nel punto più alto della linea, può essere necessario o applicare una forza di aspirazione sul lato opposto della linea o tentare di abbassare la parte più alta della linea. Una volta che questo problema è superato, il perfusato deve circolare senza problemi.
Alcune questioni devono essere monitorati per quanto riguarda il ventilatore. In primo luogo, torsione di bronchi / trachea e posizione di cuore-polmone può verificarsi come i polmoni diventano più edematosa e il peso aumenta. E 'importante per il cannule di rimanere in una posizione relativamente vicina anatomica, quindi alterare uno o entrambi cannulae può essere necessario. Pressione o ventilatori controllato il volume e la ventilazione positiva o negativa può essere utilizzato con questo sistema EVLP. Per il modello di ratto, abbiamo trovato con pressione positiva, controllata del volume di ventilazione funziona bene a volumi correnti tra 4-10 ml / kg e a pressioni positiva di fine espirazione (PEEP) tra 2-8 cmH 2 O. Tuttavia, una PEEP di 8 cmH 2 O può causare una possibile rottura alla biforcazione della trachea. Dopo ogni esperimento (o una serie di esperimenti se eseguita back-to-back), la linea di ventilazione che porta alla trachea deve essere pulito ogni lavaggio broncoalveolare (BAL) che possono aver viaggiato la trachea. Questo fluido si indurisce se lasciato intatto e in grado di bloccare completamente la linea di ventilazione.
La composizione perfusato è fondamentale per un esperimento EVLP successo. Una miscela destrano 5% consente di perfusione polmonare che è vicino alle condizioni fisiologiche, mantiene una pressione oncotica stabile per guidare fluido back nel sistema vascolare per prevenire l'edema e previene la trombosi all'interno dei vasi polmonari. È importante notare che alcune specie di ratti possono essere allergici al destrano che potrebbe causare edema polmonare 20. Il contenuto del perfusato è stato coerente in tutti i gruppi sperimentali in questo studio, quindi il contenuto destrano non dovrebbe essere un confounder. La pressione oncotica è una variabile critica che ha il potenziale di migliorare o produrre l'edema tissutale. Le soluzioni di perfusione disponibili in commercio che sono ottimizzati per l'archiviazione statica a freddo o perfusione normotermici sono stati utilizzati in questo sistema per aumentare i tempi di vitalità del polmone. Prendiamo atto che alcune di queste soluzioni contengono albumina e una preoccupazione è la possibilità di albumina bovina innescare una risposta infiammatoria nel polmone roditore. Anche se la composizione perfusato ottimale è un soggetto in corso di indagine, il perfusato deve tener conto della pressione oncotica, la capacità di pressione e di buffering osmotica. We raccomanda che la soluzione si basa su una soluzione o di coltura cellulare Krebs-Henseleit supporti modificati. La pressione oncotica deve essere mantenuto da destrano o albumina, a seconda dell'applicazione. Il tasso di pressione e di flusso di perfusione influisce sui parametri di perfusione di organi e sovra-fisiologica può fare l'organo soggetto a traumi meccanici.
Indicatori visivi durante l'esperimento:
Ci sono molti riferimenti visivi nonché indicazioni da dati in tempo reale che può essere utilizzato per determinare se un esperimento EVLP funziona bene. Il polmone rimane la stessa dimensione e si sgonfia allo stesso volume dopo ogni respiro. Ci saranno anche senza perdite dal polmone stesso. Il PVR, il peso del polmone, e la conformità rimarrà relativamente costante. Produzione di ossigeno rimarrà costante o aumentare leggermente.
Ci sono molti indicatori visivi quando il polmone viene compromesso durante un esperimento. Il polmone diventa edematosa unnd cresce rapidamente in dimensioni e peso. Il colore dei cambiamenti polmonari (da un tan-rosa al bianco) e sacche di liquido può essere identificato nel tessuto. Se la trachea o polmonari rotture da barotrauma o oltre distensione, ci sarà spumeggiante dal punto di lesioni (Figura 12B). Produzione di ossigeno diminuisce e il PVR e la conformità aumenterà notevolmente pure.
Il potenziale di utilizzare un modello di EVLP su piccoli animali come roditori apre la porta per gli studi futuri migliorare il trattamento dei trapianti di polmone. Tuttavia, il piccolo modello animale richiede una migliore comprensione di imitare veramente un trapianto di polmone. Questo modello può essere utilizzato in futuro per migliorare trattamenti medici e definire i parametri di base per i futuri studi trapianto polmonare.
The authors have nothing to disclose.
Gli autori vorrebbero riconoscere l'assistenza di Harvard Apparatus, soprattutto Stephanie Pazniokas, MS (Fisiologia Sistemi e Medicina Rigenerativa) per la loro assistenza nel circuito di assemblaggio, la modifica e la risoluzione dei problemi del circuito di perfusione e XVIVO Perfusion (Daniele Martinelli, CCP, CTP) per fornendo uso non clinico plegia polmonare.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
IPL-2 Basic Lung Perfusion System | Harvard Apparatus | ||
Tweezer #5 stainless steel, curved 11cm | Kent Scientific Corporation | IND500232 | |
Tweezer #5 Dumostar, 11cm | Kent Scientific Corporation | INS500085-A | |
Tweezer #7 Titanium, 12cm tips curved | Kent Scientific Corporation | INS600187 | |
McPherson-Vannas Scissors 8cm, Str 5mm | Kent Scientific Corporation | INS14124 | |
Vannas Scissors 8cm Str 5mm | Kent Scientific Corporation | INS14003 | |
Instrument Sterilization Tray 5" x 7" | Kent Scientific Corporation | INS800101 | |
Heparin 30,000 units per 30mL | APP Pharmaceuticals | Supplied from OSU Pharmacy | |
Ketamine 500mg per 5mL | JHP Pharmaceuticals | Supplied from OSU Pharmacy | |
Xylazine 100mg per 1mL | Akorn | Supplied from OSU Pharmacy | |
10cc insulin syringe 29 Ga x 1/2" needle | B-D | 309301 | |
Hyflex NBR | Ansell | S-17310M | Bite proof gloves |
BL1500 | Sartarius | Practum 1102-1S | Scale |
Large Flat Bottom Restrainer | Braintree Scientific Inc | FB L 3.375 dia x 8.5, 250-500gm rat | Rat tunnel for injection |
Sterling Nitrile Powder-free Exam Gloves, Large | Kiberly-Clark | 50708 | |
Rapidpoint 405 | Siemens | blood gas analyzer | |
Fiberoxygenator D150 | Hugo Sachs Elektronik | PY2 73-3762 | |
LabChart v7.3.7 | ADInstruments | ||
Tracheal cannula | Harvard Apparatus | 733557 | |
Pulmonary Artery cannula | Harvard Apparatus | 730710 | |
Left Atrium cannula | Harvard Apparatus | 730712 | |
Peristaltic Pump | Ismatec | ISM 827B | |
Small Animal Ventilator model 683 | Harvard Apparatus | 55-000 | |
Ecoline Star Edition 003, E100 | Lauda | LCK 1879 | Water Heater |
Tubing Cassette | Cole-Parmer | IS 0649 | |
Connect kit D150 | Cole-Parmer | VK 73-3763 | |
PowerLab 8/35 | ADInstruments | 730045 | |
TAM-A transducer amplifier module type 705/1 | Hugo Sachs – Harvard Apparatus | 73-0065 | |
TAM-D transducer amplifier type 705/2 | Hugo Sachs – Harvard Apparatus | 73-1793 | |
SCP Servo controller for perfusion type 704 | Hugo Sachs – Harvard Apparatus | 732806 | |
CFBA carrier frequency bridge amplifier type 672 | Hugo Sachs – Harvard Apparatus | 731747 | |
VCM ventilator control module type 681 | Hugo Sachs – Harvard Apparatus | 731741 | |
TCM time control module type 686 | Hugo Sachs – Harvard Apparatus | 731750 | |
IL2 Tube set for perfusate | Harvard Apparatus | 733842 | |
Tube set for moist chamber | Harvard Apparatus | 73V83157 | |
Tygon E-3603 Tubing 2.4mm ID | Harvard Apparatus | 721017 | perfusate line entering lung |
Tygon E-3603 Tubing 3.2mm ID | Harvard Apparatus | 721019 | perfusate line leaving lung |
low potassium dextran glucose solution | flushing the lung |