Elettroporazione di effettori batterici funzionali in cellule di mammifero
Summary
Electroporation was used to insert purified bacterial virulence effector proteins directly into living eukaryotic cells. Protein localization was monitored by confocal immunofluorescence microscopy. This method allows for studies on trafficking, function, and protein-protein interactions using active exogenous proteins, avoiding the need for heterologous expression in eukaryotic cells.
Abstract
Lo studio delle interazioni proteiche nel contesto di cellule viventi in grado di generare informazioni critiche sulla localizzazione, la dinamica, ei partner che interagiscono. Questa informazione è particolarmente importante nel contesto delle interazioni ospite-patogeno. Molte proteine patogeni funzionano all'interno delle cellule ospiti in una varietà di modo come, consentendo l'evasione del sistema immunitario ospite e la sopravvivenza all'interno dell'ambiente intracellulare. Per studiare queste interazioni ospite-patogeno cellula di proteine, diversi approcci sono comunemente usati, tra cui: in infezione vivo con un ceppo che esprime una proteina tag o mutante, o l'introduzione di geni patogeni tramite trasfezione o trasduzione. Ciascuno di questi approcci ha vantaggi e svantaggi. Abbiamo cercato un mezzo per introdurre direttamente proteine esogene in cellule. L'elettroporazione è comunemente utilizzato per introdurre acidi nucleici nelle cellule, ma è più raramente applicata alle proteine anche se la base biofisico è esattamente la stessa.Un elettroporatore standard è stato utilizzato per introdurre effettori batterici affinità con tag nelle cellule di mammifero. Macrofagi epiteliali e mouse umani sono stati coltivati con metodi tradizionali, indipendente, e collocati in 0,4 centimetri cuvette gap elettroporazione con esogeno proteine patogeno batterico di interesse (ad esempio Salmonella Typhimurium GtgE). Dopo l'elettroporazione (0,3 kV) e una breve (4 ore) periodo di recupero, la proteina intracellulare è stata verificata mediante l'etichettatura fluorescente proteina tramite il suo tag affinità e di esaminare la distribuzione spaziale e temporale mediante microscopia confocale. La proteina elettroporate stato anche dimostrato di essere funzionale all'interno della cellula e capace di corretta traffico subcellulare e l'interazione proteina-proteina. Mentre le proteine esogene tendevano ad accumularsi sulla superficie delle cellule, i campioni avevano elettroporate elevato aumento intracellulare concentrazione effettore rispetto alla sola incubazione. Il protocollo è semplice e abbastanza veloce da fare in apmoda arallel, permettendo la caratterizzazione high-throughput di proteine patogeni in cellule ospiti tra cui il targeting e la funzione delle proteine di virulenza subcellulare.
Introduction
Molti batteri Gram-negativi impiegano sistemi di secrezione specializzati per iniettare proteine di virulenza correlate (denominate effettori) direttamente nelle cellule ospiti 1-5. Questi effettori hanno una vasta gamma di funzioni biologiche, tra cui: la soppressione di immunità dell'ospite, cambiamenti del citoscheletro, la modifica del traffico intracellulare e segnalazione, i cambiamenti trascrizionali, e le alterazioni del proteasoma ospite 6-9. Le funzioni di alcuni effettori sono noti, tuttavia gli obiettivi host e azione biochimica (s) di molti altri rimane da determinare. Confrontando wild-type e infezioni batteriche ricombinanti è un valido approccio per studiare i meccanismi effettori di virulenza intracellulari, è spesso vantaggioso introdurre un individuo effettore nella cellula ospite. Così, metodi semplici per introdurre e caratterizzare proteine batteriche effettrici nel contesto delle cellule ospiti è altamente desiderabile.
Semplificare l'analisi sperimentale wi° un singolo effettore è critica come altri effettori possono avere funzioni opposte o ridondanti. Per realizzare questa semplificazione, i ricercatori hanno già introdotto macromolecole nelle cellule da molti metodi diversi, tra cui trasduzione virale 10, microiniezione 11, raschiare il caricamento 12,13, fusione cellulare con microiniezione indotta chimicamente 14, proteine proprietarie "transfezione" reagenti 15, precipitazioni fosfato di calcio 16, 17-20 e elettroporazione. Le molecole introdotte vanno da acidi nucleici, tra cui specie DNA, RNA, e RNAi alle proteine, coloranti cellule impermeabili, e anticorpi per bersagli intracellulari 21,22. Alcuni metodi hanno dei limiti, tra cui il tipo di macromolecola che può essere introdotta, e particolari analisi a valle possono essere limitate a causa dell'alta tossicità cellulare, meccanismi dannosi di azione, bassa efficacia, efficienza o l'introduzione. Transfection, un ofteMetodo n-utilizzata per esprimere geni batterici in cellule di mammifero, soffre anche la limitazione che alcuni tipi di cellule ospite rilevanti, come macrofagi e cellule primarie, sono particolarmente resistenti verso trasfezione. Oltre a ciò, è difficile controllare i livelli della proteina batterica realizzano su introduzione di DNA estraneo.
Molto lavoro ha stabilito l'elettroporazione di acidi nucleici nelle cellule sia batteriche e di mammifero come tecnica di laboratorio comune; tuttavia, non vi è la continua ricerca di metodi migliori per la consegna di proteine in cellule in condizioni fisiologiche. Rapporti su proteine trasfezione sono promettenti, ma richiedono reagenti costosi e l'ottimizzazione. Il desiderio di introdurre effettori batterici potenzialmente tossiche in un'ampia varietà di bersagli cellulari con un costo minimo ci ha portato a considerare elettroporazione come metodo per studiare queste proteine in vivo.
Protein elettroporazione 23-25 è un conosciutoHOD introdurre proteine in cellule viventi attraverso electropermeabilization, noto anche come elettro-trasfezione o elettro-iniezione 26. Questa tecnica utilizza impulsi elettrici ad alta intensità per creare pori nelle membrane cellulari. Questi pori reversibili consentono macromolecole che sono normalmente esclusi dallo spazio intracellulare di entrare nella cellula. Alla rimozione del campo elettrico esterno, la membrana può sigillare, permettendo alla cellula di mantenere molecole che passano attraverso i pori 27,28.
Un elettroporatore standard è stato utilizzato in questo studio per introdurre costantemente effettori batterici in entrambi i macrofagi di topo e cellule epiteliali umane. Il metodo è veloce, efficace e poco costoso, senza diminuzione apprezzabile vitalità cellulare. Le proteine introdotte possono essere visualizzati tramite immunofluorescenza o utilizzati per test funzionali. Questo è stato dimostrato utilizzando proteina fluorescente verde (GFP) come standard non tossico, nonchédue proteine effettrici Salmonella, SspH1 e GtgE. Proponiamo proteina elettroporazione come strumento aggiuntivo nel repertorio per lo studio delle proteine di virulenza batterica e le loro funzioni in cellule ospiti eucariotiche.
Protocol
Representative Results
Discussion
Effettori secreti dai batteri patogeni si sono evoluti per funzionare nell'ambiente cellula ospite e quindi è utile per loro studiare in situ all'interno dell'ospite. Introduzione di effettori specifici di interesse nelle cellule ospiti permette pertinenti interazioni patogeno-ospite da studiare in isolamento senza interferenze da altre proteine batteriche. L'obiettivo era di esplorare elettroporazione come un mezzo per introdurre le proteine effettrici batteriche nelle cellule ospi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by NIGMS, National Institutes of Health (GM094623). Significant portions of this work were performed in the Environmental Molecular Sciences Laboratory, a DOE/BER national scientific user facility located at the Pacific Northwest National Laboratory (PNNL). PNNL is operated for the DOE by Battelle under Contract DE-AC05-76RLO1830.
Materials
| Material or Equipment | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-EDTA Solution | Cellgro | 25-050-Cl | |
| 0.4cm Gap-disposable electroporation cuvettes | Bio-Rad | 165-2088 | |
| 100% Methanol | Any | N/A | Flammable, Toxic |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4919 | |
| Cell Counting Apparatus – Hemocytometer or Coulter Counter | Beckman Coulter | Model Z1 | |
| Cell Culture Incubator | Any | N/A | Humidified 95% air/5% CO2 atmosphere at 37 °C |
| Cell Culture Plastic | Any | N/A | Cell culture flasks/plates, pipets, tubes, rubber policeman |
| Dulbecco's Modification of Eagle’s Medium (DMEM) | Cellgro | 10-013 | Warm to 37 °C |
| Electroporator | Bio-Rad | E. coli Pulser | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Cellgro | 35-016-CV | |
| Fluorescent confocal microscope | Ziess | Model LSM 710 | |
| Glass Bottom Dishes for Microscopy | Wilco Wells | HBSt-3522 | |
| HALT Protease Inhibitor Cocktail | Pierce | 78430 | Corrosive, Toxic |
| HeLa Cell Line | ATCC | ATCC CCL-2 | |
| LDS 4X Loading Buffer | Invitrogen | NP0007 | |
| Minimal Essential Medium (MEM) | Cellgro | 10-010 | Warm to 37 °C |
| Other fluorescent stains (WGA, DAPI) in conjunction with anti-fade reagent | Any | N/A | |
| Penicillin/Streptomycin | Cellgro | 30-002-Cl | |
| RAW 264.7 Cell line | ATCC | TIB-71 | |
| Primary Antibody Against Target of Interest | Any | N/A | |
| Secondary Antibody Conjugated to Fluorophore | Any | N/A | |
| Phosphate Buffered Saline | Any | N/A | Chill to 4 °C |
| Sterile Phosphate Buffered Saline | Any | N/A | Warm to 37 °C |
| Streptavidin Agarose Resin Suspension | Pierce | 20353 | |
| Table Top Centrifuge Capable of Accepting Conical Tubes (swinging bucket preferred) | Any | N/A | |
| TCEP | Sigma-Aldrich | 646547 | Corrosive, Toxic |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8585 | Irritant, Toxic |
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