De reconstitutie van het transmembraan eiwit, KvAP, in grote unilamellaire vesicles (GUVs) is aangetoond voor twee dehydratatie-rehydratatie methode – electroformation en gel ondersteunde zwelling. In beide werkwijzen worden kleine unilamellaire blaasjes die het eiwit gefuseerd aan GUVs die vervolgens kan worden onderzocht door fluorescentie microscopie en patch-clamp elektrofysiologie vormen.
Giant Unilamellaire Vesicles (GUVs) zijn een populaire biomimetic voor het bestuderen membraan samenhangende verschijnselen. Echter, vaak gebruikte protocollen groeien GUVs, dient te GUVs houdende functionele transmembraan proteïnen worden gemodificeerd. Dit artikel beschrijft twee dehydratatie-rehydratatie methoden – electroformation en gel bijgestaan zwelling – naar GUVs met de voltage-gated kalium kanaal, KvAP vormen. In beide werkwijzen wordt een oplossing van eiwithoudende unilamellaire vesicles gedeeltelijk gedehydrateerd om een stapel membranen, die vervolgens wordt zwellen in een rehydratatie buffer te vormen. Voor de electroformation werkwijze wordt de film afgezet op platinaelektroden zodat een wisselveld in tijdens rehydratatie kunnen worden toegepast. Daarentegen gebruikt de gel ondersteunde zwelling werkwijze een agarosegel substraat film rehydratatie verbeteren. Beide methoden kunnen GUVs in lage (bijvoorbeeld 5 mM) en fysiologische (bv, 100 mM) zoutconcentraties produceren. De resulterende GUVs gekenmerkt door fluorescentie microscopie, en de functie van gereconstitueerde kanalen gemeten met de inside-out patch-clamp configuratie. Terwijl zwelling in aanwezigheid van een wisselend elektrisch veld (electroformation) geeft een hoge opbrengst van foutloze GUVs, produceert de gel ondersteunde zwelling werkwijze een homogeen eiwit verdeling en vereist geen speciale apparatuur.
Bij het bestuderen van de fysische principes die levende systemen regeren, bottom-up aanpak kan een experimentator om systeem samenstelling en andere parameters die niet gemakkelijk worden gemanipuleerd in cel-gebaseerde systemen 1 beheersen. Bij membraan processen, Giant Unilamellaire Vesicles (GUVs, diameter ~ 1-100 um) hebben bewezen een zeer nuttige biomimetische systeem 2-7 als ze goed geschikt voor microscopie studies en micromanipulatie 8-10. Hoewel er veel verschillende protocollen om GUVs produceren, de meeste vallen in twee categorieën – emulsie gebaseerde benaderingen 11,12 en technieken gebaseerd op rehydrating een lipide film 13-16. In-emulsie gebaseerde methoden, worden de binnenste en buitenste blaadjes van de GUV membranen samengesteld sequentieel uit lipide monolagen aan water / olie-interfaces. Deze benadering is geschikt voor het inkapselen van oplosbare eiwitten metin de GUVs en voor het vormen GUVs asymmetrische bijsluiter lipidensamenstelling. Echter, GUVs gevormd uit emulsies sporen oplosmiddel dat het membraan de mechanische eigenschappen 17 wijzigen behouden, en de benadering is bijzonder goed geschikt voor trans- membraaneiwit reconstitutie.
Film rehydratatie werkwijzen gebaseerd op het feit dat (dehydratatie) veroorzaakt veel lipidemengsels een multilamellaire stapel membranen. Indien stapel vervolgens in contact gebracht met een waterige buffer, zal membranen in de stapel uit elkaar solventstromen tussen hen en aan het oppervlak van de stapel te verplaatsen, kunnen afzonderlijke membranen los te GUVs 13,18 (ook een ware dierentuin van vormen andere lipidische objecten). Zelfs voor optimale buffer en lipidesamenstellingen Deze klassieke "spontane zwelling" werkwijze een relatief lage opbrengst van foutvrije GUVs. Een veel gebruikte methode om de opbrengst van foutvrije GUVs boost is "electroformation221 ;, waarin een wisselstroom veld (AC) wordt toegepast tijdens folie rehydratatie. Hoewel het mechanisme blijft slecht begrepen, "electroformation" kan spectaculair GUV opbrengsten geven (> 90% in gunstige omstandigheden) voor lage zoutconcentratie buffers (<5 mM) 14,19, en kan zelfs werken in fysiologische buffers (-100 mM) met een hogere frequentie (500 Hz versus 10 Hz) wisselveld en platina elektroden 15. Een alternatieve benadering om de opbrengst van foutvrije GUVs boost "gel ondersteunde zwelling", waarbij de lipide oplossing afgezet op een polymeer gel substraat plaats van passief (bijvoorbeeld glas, PTFE) materialen in klassieke "spontane zwelling ". Wanneer de resulterende lipide / gel film wordt gerehydrateerd kan GUVs snel vormen zelfs fysiologische buffers 16,20.
Al deze methoden kunnen alleen lipide GUVs die kan worden gebruikt om membraangebonden fenomenen zoals de studie producereninteractie tussen oplosbare eiwitten en membranen. Echter, een transmembraan eiwit in GUVs nemen, zijn belangrijke wijzigingen nodig om te verzekeren dat het eiwit blijft in een functionele toestand gedurende de reconstitutie procedure. Hoewel oplossingen van lipiden in organische oplosmiddelen (bijvoorbeeld chloroform, cyclohexaan) zijn ideaal voor de productie lipidefilms, trans-membraaneiwitten zijn meestal alleen stabiel wanneer hun hydrofobe transmembraan domein is ingebed in een lipide bilaag, of omgeven door een detergent micel ( bijvoorbeeld gedurende eiwitzuivering). Aldus, het uitgangsmateriaal voor reconstitutie typisch natief membranen, gezuiverd eiwit in een reinigingsmiddel of kleine unilamellaire proteïne bevattende vesicles (proteo-SUV's) en / of multilamellaire vesicles (proteo-MLVs) gevormd door detergensverwijdering in de aanwezigheid van lipiden. De meeste methoden om deze membraaneiwitten te nemen in GUVs vallen in drie categorieën.
Direct insertion: Trans-membraaneiwit gesuspendeerd in detergens gemengd met voorgevormde, lipide only, mild detergens gesolubiliseerde GUVs en het detergens verwijderd middels biobeads 21. Terwijl conceptueel eenvoudige Deze werkwijze vereist een nauwkeurige regeling van de detergens concentratie zoals te hoge detergensconcentratie de GUVs terwijl een te lage concentratie kan het eiwit ontvouwen of aggregaat kan oplossen.
GUV / Proteo-SUV Fusion: Eiwit in proteo-SUV's wordt gecombineerd met voorgevormde, lipide-only GUVs en fusie wordt vergemakkelijkt met speciale fusogene peptiden 22 of wasmiddel 21. Typisch de omvang van de fusie is beperkt leidt tot GUVs met een laag eiwit dichtheid.
Uitdroging / Rehydratatie: A-eiwit bevatten lipide film wordt gevormd door gedeeltelijke dehydratatie van een proteo-SUV (of proteo-MLV) oplossing en GUVs worden vervolgens gekweekt als voor een zuivere lipide film. De zichtbare uitdaging is om het eiwit te beschermen tijdens de gedeeltelijke dehydratiin stap 23, maar de werkwijze is met succes gebruikt om trans-membraaneiwitten zoals bacterio, calcium-ATPase, integrine en VDAC reconstitueren in GUVs 7,23 – 25.
Dit artikel beschrijft dehydratatie / rehydratie protocollen GUVs met het voltage-gated kalium kanaal, KvAP van de hyper-thermofiele archaea, Aeropyrum pernix maken. KvAP een hoge mate van homologie met eukaryote spanningsafhankelijke kaliumkanalen 26 en een bekende kristalstructuur 27 , waardoor het een goed model voor het bestuderen van het mechanisme van spanning gating. De productie van de proteo-SUV is eerder in detail beschreven en is geen onderdeel van deze tutorial 26,28,29. Belangrijk hoeft KvAP proteo-SUV niet te worden geproduceerd voor elke GUV bereiding, aangezien ze kunnen worden opgeslagen in kleine (bijvoorbeeld 10 pi) bij -80 ° C gedurende langere tijd (> 1 jaar). Electroformationof-gel ondersteunde zwelling kan vervolgens worden gebruikt om GUVs groeien van de KvAP proteo-SUV (of proteo-MLVs).
De belangrijkste stappen voor de electroformation protocol worden geïllustreerd in figuur 1. Druppeltjes van een oplossing van SUV die het eiwit wordt afgezet op platina draden (zie figuur 2). Gedeeltelijke dehydratatie van de SUV schorsing leidt tot de vorming van een lipide eiwit film door de fusie van SUV's. Tijdens rehydratatie wordt een wisselveld op de elektroden aan de lipide lagen helpen delamineren en vorm GUVs. Een veld 10 Hz werkt goed bij het gebruik van "zoutarm" (<5 mM) rehydratatie buffer 28 en GUVs enkele uren duren om te groeien. In tegenstelling, fysiologische buffers (met ~ 100 mM zout) goed te werken met een lagere spanning, 500 Hz AC veld, maar vereisen een langdurige (~ 12 uur) zwelling periode 15. Deze methode is gebaseerd op een eerder protocol met ITO dia 24, maar gebruikt een aangepaste kamer containing twee platina draden, zoals weergegeven in figuur 2 (zie de bespreking voor details in het design en suggesties voor eenvoudigere, geïmproviseerde kamers).
Figuur 3 illustreert de gel ondersteunde zwelling methode. Het protocol werkt goed met buffers met fysiologisch zout concentraties, is een snelle en produceert GUVs met een meer homogene eiwit distributie. Echter, de opbrengst van geïsoleerde, blijkbaar defect-vrije GUVs (dat wil zeggen, de GUV membraan uniform is bij optische lengte-schalen en geen objecten omsluiten) is lager, maar het zorgt voor een voldoende aantal voor patch-clamp en micro-manipulatie experimenten . Deze methode is gebaseerd op een protocol met agarosegel alleen lipide GUVs 16 produceren en vereist minder gespecialiseerde apparatuur dan de electroformation methode.
De karakterisering van GUVs met fluorescentie microscopie wordt beschreven, evenals de procedures met behulp van een standaard patch-clamp set-up temeten KvAP activiteit in "inside-out" weggesneden membraan patches.
Groeiende eiwithoudende GUVs kan zijn moeilijker dan alleen lipide GUVs. In het bijzonder kunnen de uiteindelijke GUV rendement gevoelig afhankelijk van hoe de SUV oplossing afgezet en ontwaterd om het membraan stack. Voor iemand zonder eerdere ervaring met GUVs, kan het nuttig zijn eerst alleen groeien lipide GUVs na een gebruikelijke protocol 15,16 waarbij het membraan film wordt gevormd door lipiden uit een organisch oplosmiddel. Zodra de conventionele protocol werkt goed, kan SUV depositie en gedeeltelijke dehydratatie vervolgens worden beheerst met behulp van alleen lipide-SUV's, die ook erg behulpzaam bij het aanpassen van het protocol voor een nieuwe lipide samenstelling. Wanneer GUVs groeien betrouwbaar van alleen lipide-SUV's, dan is het maar een kleine stap om eiwithoudende GUVs uit proteo-SUV's te produceren.
Biomimetic modelsystemen zijn een belangrijk instrument voor het bestuderen van de eigenschappen en interacties van eiwitten en membranen. Vergeleken met andere gereconstitueerde systemen zoals BLMs of ondersteunde lipidemembranen, GUV systemen vertonen vele mogelijkheden waaronder aanzienlijke invloed membraan samenstelling, spanning en geometrie, maar ook als echte olie-vrij. Echter, waarin transmembraan eiwitten, zoals KvAP, in GUVs vereist aanzienlijke aanpassingen van conventionele protocollen voor slechts lipide G…
The authors have nothing to disclose.
We thank Susanne Fenz for discussing the possibility of reconstituting proteins by agarose swelling, Feng Ching Tsai for current measurements, and present and former members of the Bassereau group for support and assistance. The project was funded by the Agence Nationale de la Recherche (grant BLAN-0057-01), by the European Commission (NoE SoftComp), by the Université Pierre et Marie Curie (grant from the FED21, Dynamique des Systèmes Complexes). M.G. was supported by an Institut Curie International PhD Fellowship, S.A. by a fellowship from the Fondation pour la Recherche Médicale, G.E.S.T. by a Marie Curie Incoming International Fellowship from the European Commission and a grant from the Université Pierre et Marie Curie. The publication fees were covered by the Labex ‘CelTisPhyBio’ (ANR-11-LABX0038).
Name of the Material/Equipment |
Company | Catalog Number | Comments/ Description |
DPhPC (1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine) | Avanti Polar Lipids | 850356P | |
Egg PC L-α-phosphatidylcholine (Egg, Chicken) | Avanti Polar Lipids | 840051P | |
Egg PA L-α-phosphatidic acid (Egg, Chicken) | Avanti Polar Lipids | 840101P | |
18:1 (Δ9-Cis) PC (DOPC) 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | 850375P | |
cholesterol (ovine wool, >98%) | Avanti Polar Lipids | 700000P | |
TRed-DHPE | Invirtogen | T-1395MP | labeled lipid |
BPTR-Ceramide | Invirtogen | D-7540 | labeled lipid |
Choloroform | VWR | 22711.290 | AnalaR Normapur |
Acetone | VWR | 20066.296 | AnalaR Normapur |
Ethanol | VWR | 20821.330 | AnalaR Normapur |
Kimwipe | Kimtech | 7552 | |
Hamilton syringes | Hamilton Bonaduz AG | diverse | |
Amber vials and teflon cups | Sigma | SU860083 and SU860076 | |
Parafilm | VWR | 291-1214 | |
microcentrifuge tube | eppendorf | diverse | |
Agarose | Euromex | LM3 (1670-B, Tg 25.7C, Tm 64C) | |
Sucrose | Sigma | 84097-1kg | |
Glucose | Sigma | G8270-1kg | |
Trehalose | Sigma | T9531-25G | |
KCl | Sigma | P9333-1kg | |
Hepes | Sigma | H3375-100G | |
TRIS | Euromex | EU0011-A | |
Osmometer | Wescor | Vapro | |
pH meter | Schott instruments | Lab850 | |
Sonicator | Elmasonic | S 180 H | |
Syringe filter 0.2µm | Sartorius steim | Minisart 16532 | |
Function generator | TTi | TG315 | |
Platinum wires | Goodfellow | LS413074 | 99.99+%, d=0.5mm |
Polytetrafluoroethylene | Goodfellow | ||
Dow Corning 'high vacuum grease' | VWR | 1597418 | |
sealing paste | Vitrex medical A/S, Denmark | REF 140014 | Sigillum Wax |
Cover slides 22×40 mm No1,5 | VWR | 631-0136 | |
Cover slides 22×22 mm No1,5 | VWR | 631-0125 | |
plasma cleaner | Harrick | PDC-32G | airplasma, setting 'high' |
petri dishes | Falcon BD | REF 353001 | 3.5 cmx1cm |
patch clamp amplifier | Axon instruments | Multiclamp700B | |
DAQ Card | National Instruments | PCI-6221 | |
Labview | National Instruments | version 8.6 | |
Glass pipettes boro silicate OD 1mm ID 0.58mm | Harvard Apparatus | GC100-15 | |
Electrode holder | Warner Instruments | Q45W-T10P | |
Micromanipulator | Sutter | MP-285 | |
pipette puller | Sutter | P-2000 | |
Camera | ProSilica | GC1380 | |
Zeiss microscope | Zeiss | Axiovert 135 | |
Objective | Zeiss | 40x long working distance, Phase contrast | |
Objective | Zeiss | 100x Plan-Apochromat NA 1.3 | |
Filterset GFP (for Alexa-488) | Horiba | XF100-3 | |
Filterset Cy3 (for TexasRed) | Horiba | XF101-2 | |
beta-casein | Sigma | C6905-1G | |
confocal microscope | Nikon Eclipse TE 2000-E | D-Eclipse C1 confocal head | |
Objective | Nikon | Plan Fluor 100× NA1.3 | |
matlab | Mathworks | for image processing and analysis of the current traces |