In vitro analysis of class switch recombination in mice is challenging due to cytophilic IgE molecules bound to Fc receptors on the surface of B cells. We describe a method for IgE detection using trypsin-mediated cleavage of surface-bound IgE prior to fixation and permeabilization for cytoplasmic fluorescence staining.
B اللمفاويات المناعي السلسلة الثقيلة (IGH) إعادة التركيب تبديل فئة (CSR) هو عملية حيث أعرب في البداية الغلوبولين المناعي بالتبديل إلى isotypes IGH أخرى، مثل ايغا، فريق الخبراء الحكومي الدولي ومفتش. قياس IGH CSR في المختبر هو الطريقة الرئيسية لدراسة عدد من العمليات البيولوجية التي تتراوح بين إعادة التركيب وإصلاح الحمض النووي لجوانب علم المناعة الجزيئية والخلوية. في المختبر CSR فحص ينطوي على تدفق cytometric سطح قياس التعبير IG على خلايا B تفعيلها. في حين قياس ايغا ومفتش فرعية واضح ومباشر، وقياس إيج بواسطة هذه الطريقة هو إشكالية بسبب ذوبان فريق الخبراء الحكومي الدولي ملزم لFcεRII / أعرب CD23 على سطح خلايا B تفعيلها. نحن هنا وصف الإجراء فريدة من نوعها لقياس دقيق لإيج المنتجة للخلايا فأر B التي خضعت المسؤولية الاجتماعية للشركات في الثقافة. وتستند هذه الطريقة على بوساطة التربسين الانقسام المجمعات إيج-CD23 على سطوح الخلايا، مما يسمح للكشف عن إيج المنتجة للخلايا B النسب التي كتبها قبرصيتلطيخ toplasmic. يقدم هذا الإجراء حلا ملائما لتحليل تدفق cytometric من المسؤولية الاجتماعية للشركات لفريق الخبراء الحكومي الدولي.
خلال المناعي السلسلة الثقيلة (IGH) إعادة التركيب تبديل فئة (CSR) في الفئران والبشر، وIGH μ يتم حذف الإكسونات المنطقة ثابتة (Cμ) والاستعاضة عن واحدة من عدة مجموعات من المصب الإكسونات المنطقة ثابتة (C H ق) (على سبيل المثال Cγ، Cε، وCα)، مما أدى إلى التحول من إنتاج الغلوبولين المناعي لإنتاج الطبقات الإيج أخرى (على سبيل المثال مفتش، فريق الخبراء الحكومي الدولي، أو ايغا). يحدث CSR داخل التبديل (S) المناطق، والتي هي 1-10 متواليات كيلوبايت تقع 5 'إلى كل مجموعة من C H ق 1. انزيم تفعيل الناتج عن سيتيدين نازعة أمين (AID) يبدأ CSR عبر النشاط سيتيدين نزع الأمين.
فريق الخبراء الحكومي الدولي هو الوسيط الرئيسي من أمراض الحساسية (2) وفهم أكبر لكيفية إنتاج إيج وينظم قد فتح الأبواب أمام طرق علاجية جديدة لمرض الجلد التأتبي. في الفئران والبشر، فريق الخبراء الحكومي الدولي هو الإيج نمط إسوي ينظم الأكثر بإحكام. تم الكشف عن فريق الخبراء الحكومي الدولي عادة عند مستويات الآلاف من تيموفاق أقل من غيرها من IGH isotypes 3، ولكن يمكن أن تكون مرتفعة للغاية في الحالات المرضية 4. ومع ذلك، المسؤولية الاجتماعية للشركات لفريق الخبراء الحكومي الدولي وغير مفهومة تماما. في المختبر تنشيط خلايا B يستخدم IL-4 في تركيبة مع أي من مكافحة CD40 أو LPS، يدفع المسؤولية الاجتماعية للشركات على حد سواء IgG1 وفريق الخبراء الحكومي الدولي 5. خلايا B تفعيلها تعبر عن وجهة منخفضة تقارب إيج مستقبلات FcεRII / CD23 2،6، الذي يربط ذوبان إيج يفرز في الثقافة بعد CSR. لذلك عند تحليل مع التدفق الخلوي، الخلايا البائية مع مستقبلات محددة إيج وصمة عار على نحو مماثل لB الخلايا معربا عن التطور الطبيعي إيج 7. في حين أنه من المعروف أن الفأر B خلايا تعبر عن وجهة تقارب منخفضة مفتش مستقبلات FcγRIIB1 (CD32) 8، في تجربتنا أنه لا يبدو أن تتداخل مع قياس درجة التحول إلى IgG1. ومع ذلك، عند قياس إيج التبديل بعد تنشيط الخلايا B في الثقافة، وفريق الخبراء الحكومي الدولي ملزمة أرض غير محددة قد تحجب التحليل. مع أساليب تلطيخ المشتركة، والخلايا غير إيج-التعبير عن وصمة عار إيجابيا لفريق الخبراء الحكومي الدولي.
المبين هنا هو الاستراتيجية التي تم استخدامها لإجراء فحوصات CSR وكشف عن خلايا B-التعبير عن فريق الخبراء الحكومي الدولي الحقيقية من الفئران 9-11. علاج الخلايا B تفعيلها مع التربسين، كاشف مختبر مشترك لهضم البروتين، ويزيل سطح كل من cytophylic وغشاء ملزمة الجلوبيولين. permeabilization لاحق وتلطيخ للحشوية إيج بالتالي يكشف عن الخلايا المنتجة للإيج الحقيقية.
سوف تحفيز الماوس الطحال خلايا B في الثقافة مع مكافحة CD40 وIL-4 محاكاة T نوع المساعد 2 (T H 2) التفاعلات، وتشجيع التحول فئة لIgG1 وفريق الخبراء الحكومي الدولي 5. خلايا B يمكن تفعيلها عن المسؤولية الاجتماعية للشركات في سياق من إجمالي splenocytes 12 أو خلايا B الطحال تن?…
The authors have nothing to disclose.
ويدعم DRW من المنح NIH AI089972 وAI113217، وفريق الدراسات المناعة المخاطية، وحاصل على جائزة الوظيفي للعلماء الطب من صندوق ويلكوم بوروز.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Anti-Mouse IgE FITC | BD Pharmingen | 553415 | clone R35-72 |
Rat Anti-Mouse IgG1 PE | BD Pharmingen | 550083 | clone A85-1 |
Methanol | BDH | BDH1135-4LP | Keep at -20 °C |
Falcon Cell Strainer 40 µm Nylon | Corning | 352340 | |
Falcon Cell Strainer 70 µm Nylon | Corning | 352350 | |
Anti-Hu/Mo CD45R(B220) PerCP-Cy5.5 | eBioscience | 45-4052-82 | clone RA3-6B2 |
anti-Mouse/Rat CD40 | eBioscience | 16-0402-85 | clone HM40-3 |
RPMI Medium 1640 | Gibco | 11875-093 | |
HEPES (1M) | Gibco | 15630-080 | |
MEM-NEAA (100X) | Gibco | 11140-050 | |
Phosphate Buffered Saline (10X) | Lifetechnologies (Corning) | 46-013-CM | |
MACS CD45R (B220) microbeads | Miltenyi Biotec | 130-049-501 | |
MACS purification column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
IL-4 | PeproTech | 214-14 | Reconstitute in water or 0.1% BSA |
Formalin Solution, Neutral Buffered, 10% | Sigma Aldrich | HT501128-4L | |
Trypsin-EDTA Solution (10X) | Sigma Aldrich | T4174-100mL | 5.0g Trypsin, 2.0g EDTAŸ4Na per Liter of 0.9% NaCl |
Penicillin-Streptomycin | Sigma Aldrich | P0781-100mL | 10,000U Penicillin; 10 mg/mL Streptomycin (100X) |
L-Glutamine 200mM | Sigma Aldrich | G7513 | |
2-mercaptoethanol (99%) | Sigma Aldrich | M6250-100mL | |
Red cell lysis buffer | Sigma Aldrich | R7757 | |
Rat Anti-Mouse IgM RPE/cy7 | SouthernBiotech | 1140-17 | clone 1B4B1 |
HyClone Fetal Calf Serum | Thermo | SH30910.03 | |
B cell Stimulation media | B cell stimulation media consists of RPMI with fetal calf serum (15%), 20 mM HEPES, 1X MEM-NEAA, 2.0mM L-glutamine, 1X Penicillin-Streptomycin (Penicillin:100 U/ml, Streptomycin: 100 µg/ml), Beta-mercaptoethanol (7 µL/L), IL-4 (20 ng/mL), and anti-CD40 (1 µg/mL) |